184750. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxa-béta-laktám-dikarbonsav antibiotikum D-diammóniumsójának előállítására
1 2 At ammónlum-hidroxid hozzáadása előtt a dikarbonsav vizes oldatát acetonnal hígítjuk, előnyösen 10 térfogati acetont használunk, de ennél több vagy kevesebb is alkalmazható. Az eljárásban előnyösen tömény ammónium-hidroxid-oldatot használunk, mivel hígabb lúgoldatok esetén a kristályosítandó oldat térfogata nagyobb lesz, amihez több acetont kell adni. Üzemi szintű kristályosításoknál lehetőleg kerülni kell a nagyobb térfogatokat. Úgy is eljárhatunk, hogy acetonos ammónium-hidroxid-oldatot adunk a dikarbonsav vizes oldatához a pH beállítása céljából. Előnyösek az ln- 1,5n oldatok. A kívánt pH úgy is beállítható, hogy hűtés közben ammóniagázt vezetünk be a vizes dikarbonsavoldatba. Mint említettük, az acetonnal hígított vizes dikarbonsavoldat pH-ját ammóriium-hidroxiddal 6-7,5-re állítjuk be, előnyösen 6,5-re. Miután a pH-t az ammómum-hidroxiddal beállítottuk, az oldatot addig hígítjuk acetonnal, amíg az oldat zavarossá válik. A kristályos diammóniumsó a zavaros oldatból L-epimertől lényegében mentes D-epimer formában kristályosodik ki. A kristályokat szűréssel, centrifugálással vagy más alkalmas elválasztó művelettel összegyűjtjük, az anyalúgtól mosással megszabadítjuk és szárítjuk. A találmány szerinti eljárásban a D-diammóniumsó kitermelése általában legalább 85%. Az eljárást célszerűen 15-30 °C között, előnyösen 25 °C-on hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárás pH- és hőmérsékletkörülményei között az oldatban képződött oxa-beta-laktám-dikarbonsav és a dikarbonsav diammóniumsója gyors epimerizálódásnak indul az alfa-karboxo-p-hidroxi-fenil-acetil-oldallánc kiralitással rendelkező centrumánál. Ha például a kiindulási dikarbonsav L-konfigurációjú, a dikarbonsav vagy a diammóniumsó az oldatban gyorsan a D- és az L-epimer egyensúlyi keverékévé epimerizáíódik. Az egyensúlyt felborítja a kristályos D-diammóniumsó kiválása, amint ezt az 1. diagram mutatja. Így mivel a D-diammóniumsó a só legkevésbé oldható epimerjeként kristályosodik ki, az oldatban végbemenő gyors epimerizádó az egyensúlyhoz igazodva további D-diammóniumsót produkál, amely az oldatból kikristályosodik. A fent leírt gyors cpimerizádót elősegíti a 15-30 °C reakdóhőmérséklet, leginkább a 25 °C. A hőmérséklet csökkenése az epimerizádó sebességének csökkenésével jár, ami lassúbb kristályosodáshoz és a D-diammóniumsó kisebb kitermeléséhez vezet. Bár az alacsonyabb hőmérséklet csökkenti a D-diammóniumsó oldhatóságát,' mégis kevesebb só nyerhető ki a kristályosítandó oldatból az epimrizádó sebességének csökkenése miatt. Â találmány szerinti eljárás feltételei között magas kitermeléssel kapunk kristályos D-diammóniumsót, mivel gyors epimerizálódás megy végbe és a diammóniumsó D-epimerje lényegében oldhatatlan. Az eljárásban alkalmazott hőmérsékletek felett az epimerizádó fokozódik, nő azonban a D-epimer oldhatósága, ami a kinyerhető kristályos só alacsonyabb kitermelését eredményezi. Az oxa-beta-laktám-diammóniumsó D-epimeijét az L-epimertől alapvetően mentes formában állítjuk elő a találmány szerinti eljárással. Az L-epimertől alapvetően mentes meghatározás legalább 95% D-epimert jelent. A D-epimer %-át a kristályos diammóniumsó termékben nagynyomású foíyadékkromatográflával (HPLC) határozzuk meg. Egy a D- és az L-epimer %os mennyiségének meghatározására használt HPLC- rendszer a következő volt: Oszlop: Water’s Assodates Bonapak C-18 Áramlási sebesség: 3ml/perc Oldószer: 100 rész 0,ln ammóníum-catát-oldat 6 rész metanol Minta-oldószer: foszfát-puffer, pH 7,4 Minta-koncentrádó: 1 mg/mg Minta-térfogat: 15 mikroliter. A találmány szerinti só előállítáásra használt D,L-oxa-beta-laktám-dikarbonsav nagynyomású folyadékkromatográfiával választható szét feldúsított D- epimerre és L-epimerre az eljárás céljára. Előnyösen D,L-dikarbonsavat használunk. A találmány szerint másrészről nagyobb epimertisztaságú kristályos D-diammóniumsót kapunk, lényegileg L-epimer formában levő, nem kristályos diammóniumdóval együtt. A találmány kristályosító eljárásról is gondoskodik a D-diammóniumsó számára, eszerint a diammóniumsót vízben oldjuk és a zavarosodási pont eléréséig vízzel elegyedő szerves oldószert, mint etanolt, izopropanolt, n-propanolt vagy acetonitril adunk hozzá A zavarosodásí ponton tartva L-diammóniumsótól alapvetően mentes D-diammóniumsó kristályosodik ki az oldatból. A kristályosító eljárást 20-35 °C-on hajtjuk végre. A kristályosító folyamat jellemző vonása, hogy a diammóniumsó D-epimeije szelektíven kristályosodik ki a vizes oldatból. A kristályosításban használt nem kristályos diammóniumsó a D- és az L-epimer változó arányú keveréke lehet. Például a diammóniumsó HPLC-vel D-epimerben feldúsítható, vagy a két epimer mintegy 50:50 arányú keverékéből állhat. Bár a vizes oldatban a diammóniumsó nem kristályos epimer keverékének koncentrádója nem kritikus, mégis ha ez a koncentrádó túlságosan alacsony, nagyobb térfogatú szerves oldószer van jelen, és a kitermelés általában alacsonyabb. Megfelelő koncentrádó a 0,1 -0,5 g/ml víz. A D-diammóniumsó tetrahidrátként kristályosodik ki a vizes oldatból. A kristályosító eljárásban kapott termék HPLC-elemzés szerint legalább 95% D-epimer vegyületet tartalmaz. A következő példák a találmány további ismertetésére szolgálnak. 1. példa 5 g 1 -oxa-beta-laktám-dik^bonsavat (40:60 arányú D,L-keverék) 15 ml aceton víz (90:10) elegyben oldunk és az oldathoz szobahőmérsékleten, élénk keverés közben l,4n acetonos ammónium-hidroxid-oldatot adunk 6,5 pH eléréséig. Ezután a zavarosodásí jx>ntig acetont adunk az oldathoz. Az oldatot D-dittmmóniumsó-kristályokkal beoltjuk és kikristályosodásig állni hagyjuk. A kristályos D-diammóniumsót leszűrjük, víz-izoporanol (1:9) eleggyel mossuk és szárítjuk. A száraz kristályok súlya 4,5 g. HPLC-elemzés szerint a kristályos só 97% D-epimert tartalmaz. 2. példa A D-diammónium$ó átkristályosítása 100 mg, nagyrészt D-konfigurádójú nem kristályos oxa-beta-laktám-diammóniumsót « (D-epimerben HPLC-vel feldúsítva, az eludóhoz 0,ln ammónium-acetát puffert használva) 0,5 ml vízben oldunk. Az oldatot lassan izopropanollai addig hígítjuk, amíg az oldat zavarossá válik, majd szobahőmérsékleten né-184.750 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
