184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 tillációs számlálóval mértük, hogy meghatározzuk, hogy a vizsgált minta mennyire segíti elő az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitásként jelölt, korábban részletezett reakciót. (A csapadék rádioaktivitásának erőssége arányos a dezaktivált EF-2 menynyiségével.) A kiértékeléshez előzetesen kalibrációs görbét készítettünk: EF-2*NAD* -* (ADP ribóz)-(EF-2)+nikotin-amid*H+ savban oldhatatlan A FAB fragment koncentrációjának meghatározása egyszeri gyök immundiffúzióval A Sephadex kromatográfiás oszlopról nyert frakciók 50 /rl-nyi mennyiségéhez ditio-treitolt adtunk olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 20 mmól legyen. A redukciót 37 °C-on, 30 percen át hajtottuk végre (annak érdekében, hogy a diszulfid kötés két tiol-gyökre hasadjon). Ezután jód-acetamidot adtunk egy elegyhez olyan mennyiségben, hogy koncentrációja 50 mmól legyen, és a reagáltatást 20 °C-on, 30 percen keresztül folytattuk (a tiol-gyököket védtiik). Az így előkezelt minta oldatát kecske nyúl-ellenes IgG szérumot tartalmazó agarra helyeztük és két napon keresztül állni hagytuk. Az antigén-ellenanyag reakció következtében kialakult csapadék gyűrű átmérőjét meghatároztuk és a Fab’ fragmentum koncentrációját egy előzőleg felvett kalibáricós görbe segítségével határoztuk meg. A 3—9, példák esetében azonban nem végeztünk előkezelést, és vizsgálati mintaként a kromatográfiás frakciók 50 jul-es mennyiségeit használtuk. Ezekben az esetekben nehezen lehet pontos kvantitatív eredményekhez jutni, de a kapott Kvalitatív adatok kielégítőek. 1. példa (a) A tumorellenes immunoglobulin Fab’ fragmentumok előállítása DBA/2Cr egerek hasvízéből L 1210 egér leukémia sejteket különítettünk el, amelyeket fokozatosan transzplantáltunk az egerekbe. 106 ilyen sejtből és Freund-féle teljes adjuvánsból (immuno adjuváns) készült emulziót intravénásán nyúlba injektáltunk Ezután az adjuvánssal együtt 10® L 1210 sejtet injektáltunk szubkután úton, egy héten keresztül három alkalommal, és az adagolás befejezése után hét nappal és tíz nappal vért vettünk a kezelt nyűitől. Az így kapott vérmintákat egyesítettünk, majd az egyesített mintából elkülönítettük a szérumot, és 56 °C-on 30 percen át inaktiváltuk. Az így kapott szérum (anti L 1210 szérum) 200 ml-éhez 200 ml telített vizes ammónium-szulfát oldatot adtunk 4 °C hőmérsékleten, és a kivált csapadékot (anti L 1210 immunoglibulin) centrifugálással elkülönítettük. Az így kapott csapadékot feloldottuk 50 ml 0,01 mólos foszfát-puffer (pH = 7,6) oldatban és ugyanebbe a puffer oldatba történő dialízissel tisztítottuk. így az anti-L 1210 immunoglobulin oldatához jutottunk. Az oldatot felvittük egy DEAE cellulóz kromatográfiás oszlopra (hosszúság: 94 cm, szélesség: 3 cm), amelyet ugyanezzel a foszfát-puffer oldattal egyenlítettünk ki. így olyan oldatot kaptunk, amely nem-adszorbeált frakcióként IgG-t tartalmazott. A kapott anti-L 1210 IgG oldat (30 mg/ml) 40 ml-nyi mennyiségéhez, amelyet a kromatografálással kapott oldat 0,1 mólos acélát pufferbe (pH = 4,5) dializálva kaptunk, 24 ml peps/.int adtunk. A pepszin emésztést 37 °C-on, körülbelül 18 órán keresztül végeztük, majd a kapott terméket felvittük egy 140 cm hosszú 3,5 cm átmérőjű, 6 Sephadex G200 kromatográfiás oszlopra. A körülbelül 100 000 molekulasúlyú proteint telített vizes konyhasó-oldat segítségével eluáltuk. Az elektroforézises vizsgálatok (nátrium-dodecil-szulfáttal) azt igazolták, hogy ez tisztán a Fab fragmentum dimerje volt. A Fab’ fragmentum dimerjének izotóniás nátrium-klorid oldatát 0,01 mólos TRIS.HCl-0,14 mólos nátrium-klorid - 2 mmólos etiléndiamin-tetraecetsav elegy vizes oldatába (pH = 8,3) dializáltuk, majd a kapott termék (7,3 mg/ml% 2,0 ml-éhez 0,04 ml 100 mmólos 2-merkapto-etanolt adtunk. A 2-merkapto-etanollal végzett redukciót 37 °C-on egy órán keresztül hajtottuk végre, majd a kis molekulasúlyú anyagot telített vizes konyhasó oldatba dializálva különítettük el. Az L 1210 tumorellenes immunoglobulin Fab’ fragmentumának oldatát kaptuk, ahol a fragmentum egy tiol-gyököt tartalmazott (vagy egy a hajlatban elhelyezkedő diszulfid kötésből származó tiol-gyököt). (b) A diftéria toxin A fragmentumának előállítása 18,5 ml vizes (pH = 8,3) 0,05 mólos TRIS.Hcl és 2 mmólos etilén-diamin-tetraecetsav oldathoz, amely 210 mg diftéria toxint tartalmazott, hozzáadtunk 0,15 ml 0,1 mg/ml koncentrációjú tripszin-oldatot. Az emésztést 25 °C, 50 percen át folytattuk. Ezután a reakció leállítása céljából 0,3 ml, 0,5 ml/ml koncentrációjú szójabab tripszin inhibitor oldatot adtunk hozzá. A kapott termékhez karbamidot (végkoncentráció 6 mól), nátrium-szulfátot (végkoncentráció 0,168 mól) és nátrium-tetrationátot (végkoncentráció 0,041 mól) adtunk, és az elegyet 37 °C-on, 2 órán keresztül S-szulfonáló bomlásnak vetettük alá. A kapott oldatot felvittük Sephadex G 150 (112 cm hosszú, 3,5 cm átmérőjű) kromatográfiás oszlopra, amelyet 6 mólos karbamis és 0,03 mólos ecetsav oldat elegyéből készített, 5,3 pH-értékű puffer oldattal kezeltünk. Az A fragmentumot tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. A frakciókat desztillált vízbe dializálva a tiszta A fragmentumhoz jutottunk (amely egy S-szulfo gyököt tartalmazott). (c) Tumorellenes protein hibrid előállítása Az anti-L 1210 immunoglobulin IgG (a) lépésben leírt módon előállított Fab’ fragmentumának 7,3 mgnyi mennyiségét tartalmazó 2,5 ml vizes oldatot elkevertük az diftéria toxin (b) lépésben előállított A fragmentumának (amely egy S-szulfo gyököt tartalmaz) 4.0 mg-nyi mennyiségével. A kapott oldatot 4 °C-on, 3 napon keresztül 1 liter 0,05 mól glicin-puffert, 0,10 mól nátrium-kloridot és 2 mmól etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó, 9,15 pH-értékű vizes oldatba dializáltuk, hogy a Fab fragmentumot összekapcsoljuk az A fragmentummal. A kapott terméket felvittük egy 93 cm hosszú, 1,6 cm átmérőjű Sephandex 0,150 kromatográfiás oszlopra, amelyet 5 mmól foszfát-puffért és 0,154 mól nátrium-kloridot tartalmaz, 7.0 pH-értékű vizes oldattal eluáltuk. 60, egyenként 2.1 ml-es frakciót gyűjtöttünk. A 280 m^u hullámhosszon mutatott abszorpciót minden frakció esetében meghatároztuk, hogy megállapítsuk a protein koncentrációját. A kapott eredményeket a 3. ábrán ábrázoltuk. Amint a 3. ábráról világosan látható, a protein eluálási diagramja négy csúcsot mutatott, amelyeket 1,2, 3 illetve 4 csúcsként jelöltünk, a molekulasúly szerint növekvő sorrendben. Megmértük az egyes csúcsoknak megfelelő frakciók ADP-ribóz-transzferáz aktivitását EF-2-vcl szemben. A kapott eredményeket szintén a 3, ábra mutat-184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
