184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 ráz aktivitással, míg az A fragmentum rendelkezik ezzel az aktivitással. Bár a B fragmentum nem mutatja ezt az aktivitást, alkalmas arra, hogy egy sejt receptorhoz kapcsolódjon szemben az A fragmentummal, amely nem rendelkezik ezzel a tulajdonsággal. A találmány szerinti tumorellenes protein hibrid egyik molekularésze az A fragmentumnak felel meg. Ez a fragmentum a diftéria toxin A fragmentuma, és rendelkezik az előzőekben megadott tulajdonságokkal, amelyek a következőképpen foglalhatók öszsze: (1) ADP-ribóz-transzferáz aktivitás EF-2-n (ahol EF-2 az elongation factor 2 angol kifejezés rövidítése), (2) nem kapcsolódik sejt receptorokhoz, és önmagában nem citotoxikus. Ha a fenti két feltétel teljesül, a találmány szerinti értelmezésben az A fragmentum felöleli azokat a nem toxikus proteineket, amelyeket egy mutáns termel, így például CRM 30 és CRM 45 proteineket, amelye-, két a Crynebacterium diphteriae mutánsa, így a C7 (ß 30) és C7 (ß 47) termeli, és azokat a fragmentumokat is, amelyekhez úgy jutunk, hogy mérsékelt körülmények között tripszinnel reagáltatunk proteineket, redukálószer, így egy tiol-reagens jelenlétében. Az így kapott A fragmentumot használjuk fel a találmány szerinti tumorellenes hatású protein hibrid előállítására, változatlan formában, minden további kezelés nélkül, ha legalább egy tiol-gyököt tartalmaz,, vagy tiol-gyökének S-szulfo-gyökké alakítása után, szulfit-ionokkal végzett kezeléssel. Ha a fragmentum egy diszulfid kötést tartalmaz, előzetesen olyen fragmentummá alakítjuk, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, a diszulfid kötés ismert módon végzett felhasításával. A találmány szerinti eljárásban A fragmentumként különösen előnyösen alkalmazható egy olyan fragmentum, amely egy tiol-gyököt vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz molekulájában. Az EF-2-n kifejtett ADP-ribóz transzferáz aktivitást a következőképpen definiáljuk. Az EF-2 protein elongációs faktor, amely a sejtek protein szintézisével áll kapcsolatban, és a diftéria toxin A fragmentuma dezaktiválja az EF-2-t, katalitikusán elősegítve az EF-2 és nikotin-amid-adenin-dinukleotid ÍNAD) alábbi reakcióját: EF-2*NAD -*■ (ADP ribóz)-(EF-2)»nikotin-amid+H+ Azt a tulajdonságot, hogy egy anyag képes elősegíteni ezt a reakciót, az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitásnak nevezzük. Az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz transzferáz aktivitás a protein szintézis ellen hat, és az állatokra gyakorolt letális toxicitás egyik okozója, azonban ahhoz, hogy a diftéria toxin A fragmentuma kifejtse ezt az ADP-ribóz-transzferáz aktivitást az EF-2-re, szükség van a B fragmentumra is, amely képes a sejt receptorokhoz kapcsolódni, mert csak így juthat .be az A fragmentum a sejtbe és fejtheti ki citotoxikus hatását. Az A fragmentum egyedül nem vezet az állatok elhullásához. A találmány szerint, ha a tumorellenes immunoglobulin Fab fragmentumát, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, közvetlenül a diftéria toxin A fragmentumával reagáltatjuk, amely legalább egy tiol-gyököt és/vagy S-szulfo-gyököt tartalmaz, a később részletezésre kerülő reakciókörülmények között, egy (!•) általános képletű Fab-Sj-SjFA (I) . tumorellenes protein hibridet kapunk, amely megfelel egy olyan (I) általános képletű protein hibridnek, amelynek képletében n = 0. A képletben Fab, FA, S, és S2 a korábban, az (I) általános képlettel kapcsolatban megadott jelentésű. Egyszerű előállíthatósága miatt különösen előnyös a (II) általános képletű Fab-(S, -S2-FA) (II) protein hibrid, ahol Fab, FA.'Sj és S2 a fenti jelentésű, míg p jelentése 1 vagy 2, mely azonban nem képezi a találmány tárgyát, ha p jelentése 2, A találmány szerinti protein hibridben az X-el jelölt kétvegyértékű szerves gyök n = 1 esetben egy olyan térhálósító reagensből származó szerves gyök, amely legalább két funkciós csoportot tartalmaz, és egy toluollal reagálva alkalmas egy szulfit-kötés (-S-) létrehozására. Ilyen térhálósító reagens például a (III) általános képletű bisz-meleinimid-szerkezetű molekula, -halogénkarbonil-vegyület, ahol Y jelentése feniléncsoport. Hasonló, a találmány oltalmi körébe nem tartozó protein hibridek hozhatók létre olyan (III) általános Képletű térhálósító szerekkel, amelyek képletében Y jelentése 4,4 -bisz(karbonil-amino)-azobenzol vagy -CHj -O-CHj - képletű csoport, vagy olyan (IV) általános képletű bisz-halogén-karbonil-származékokkal, amelyek képletében Z jelentése -NH-(CH2 )_-NH- képletű csoport, ahol m értéke 2—15, Xj és X2 azonos vagy különböző, és jelentése bróm- vagy jódatom. A (III) általános képletű bisz-maleinimid-származékok például a következő vegyületek: N,N’-(l,2-feni!én)-dimafeinimid, N,N’-(1,3-fenilén)-dimaleinimid, NJM’-(1,4-fenilén)-dimaleimid, 4,4 -bisz-(maleoil-amino)-azobenzol, és bisz(N-maleinimid-metil)-éter. A (IV) általános képletű bisz-halogénkarbonil-vegyületek például a következők: N,N-alkilén-bisz (bróm-acetamid) és N,N’-alkilén-bisz,(jód-acetamid) (ahol az alkilén-gyök 2—15 szénatomos). A három funkciós csoportot tartalmazó térhálósító reagensek közé tartozik például az 1,2,4-trisz(maleoil-amino)-benzol és az l,3,5-bisz(maleoil-amino)-benzol A találmány szerint a tumorellenes hatású protein hibrid a következő módszerekkel állítható elő. (1) Az egyik lehetőség, hogy egy Fab fragmentumot, amely legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmaz, reagáltatunk egy A fragmentummal, amely legalább egy tiol-gyököt tartalmaz, vagy egy legalább egy tiolgyököt tartalmazó Fab fragmentumot reagáltatunk egy legalább egy S-szulfo-gyököt tartalmazó A fragmentummal. Ennél a módszernél az A fragmentumot előnyösen 0,3—3 mól mennyiségben használjuk a Fab fragmen-Íum egy móljára számítva. A reagáltatást úgy végeztetjük, hogy a Fab fragmentumot és az A fragmentumot 6-10 pH-értékű puffer-oldatban elkeverjük, úgy, togy a teljes protein koncentráció 0,5-100 mg/ml, Még előnyösebben 1-20 mg/ml legyen, és az elegyet 0-60 °C-on állni hagyjuk, vagy a reakcióeleggyel azonos pH-értékű puffer elegybe dializáljuk. A reakcióidő 4 óra és három nap között van, a reakciókörülményektől és az előállítás volumenétől függően. Az így kapott hibrid szokásos módon különíthető el a reakcioelegyből és tisztítható, például dialízissel vagy kromatográfiás oszlopon vagy molekula szűrőn. 184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
