184490. lajstromszámú szabadalom • Eljárás extracelluláris anyagot termelő sejtek előállítására
1 184 490 2 Al nyálka A2 nyálka Kontroll anyagok 1. 0,28 2. 0,15 3. 0,0 1. 0,28 fruktóz: 0,28 2. 0,0 szacharóz: 0,15 dextrán: 0,0 (A glükóz az adott feltételek mellett nem képez szint. Az A1 nyálkában a szacharóz/'fruktóz aránya 1/20. Az Al nyálka savas hidrolízise 1 g nyálkát feloldottunk 5 ml 6 n HCl-ben, és 5 napig 32 °C-on tartottuk. Felvitel Kieselgelre lapra kétféleképpen: a) az oldatot közvetlenül vittük fel, b) 1 csepp oldat + 1 csepp 6 n NaOH + 1 csepp cc. ecetsav, a pH értéke 5—6-ra állt be. n-propanol/víz (70: 30) rendszerben az alábbi timolszulfonsav reagensre pozitív anyagok mutathatók ki. a) felvitel b) felvitel kontroll anyagok kezeletlen nyálka 1. 0,45 1. 0,58 glükóz: 0,45 1. 0,45 2. 0,45 2. 0,39 3. 0,0 A hidrolízis eredményeként tehát a kezeletlen nyálkában levő, a kromatogramon 0,0 Rf-ü anyag a hidrolizátumban nincs jelen és csak egy, a glükózzal azonos Rf-ü anyag mutatható ki, ha a felvitelt savas oldatból végeztük. Ha a felvitelt az ecetsav/ Na acetát közegből végeztük, akkor a kromatogrammon 2 cukorreagensre pozitív folt jelenik meg, és az 1./2. anyagok aránya 1/3. A fenti adatok alapján megállapítható, hogy a kezeletlen Al nyálka Rf = 0,0 komponense poliszacharid. Glükóz oxidáz teszttel (Behringer diagnosztikai teszt) meghatároztuk az MM agaron termelt (6 nap, 30 °C) Al nyálka glükóz tartalmát: 1,4 súlyn/o, a nyálka összsúlyára számolva. Egy 10 napos, MM agaron termelt A2 glükóz tartalma 1,26 súly% volt. A kromatográfiás értékelés alapján az Al és A2 nyálkában a glükóz koncentrációja azonos a fruktózéval. A nyálkák ninhidrin-pozitív anyagtartalmának a vizsgálata. A ninhidrin az aminósavak, peptidek és a szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületek, így az aminocukrok érzékeny kimutatására alkalmas. Az Al nyálkában Kieselgélen a propanol/víz (7: 3) rendszerben kromatografálva nem mutatható ki ninhidrin pozitív vegyület. A fenti adatok alapján az Al nyálka összetétele az alábbi : glükóz 1,4 % fruktóz 1,4 0/0 szacharóz 0,07 % poliszacharid 13,3 % Az A2 nyálkát Kieselgélen n-propanol/víz (7:3) rendszerben kromatografálva 8 ninhidrin pozitív foltot találtunk az alábbi R, értékekkel: 0,51; 0,44; 0,40; 0,35; 0,31; 0,26; 0,19 és 0,0. Legnagyobb koncentrációban az L-leucinnel (Rf = = 0,44) és az L-argininnel (Rf = 0,0) azonos Rf-ü anyagok vannak jelen. Ezek az anyagok valószínűleg aminósavak. A fentiek alapján megállapítható, hogy az A2 nyálka szénhidráttartalma az Al-hez hasonló: glükóz+fruktózHhpoliszacharid, és ez kiegészül aminovegyületekkel. A Bacillus megaterium Al és A2 fentiekben ismertetett mutánsok liofilezett tenyészeteit Bacillus megaterium mutáns M—1981 megjelöléssel letétbe helyeztem az Országos Közegészségügyi Intézet Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében. Letéti szám: 00203. A letétbehelyezés dátuma: 1981. március 12. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás új, poliszacharid típusú extracelluláris bakteriális nyálka előállítására azzal jellemezve, hogy Bacillus genusba tartozó baktériumsejteket hagyományos táptalajokon folyamatosan tenyésztünk akridin típusú vegyület jelenlétében, majd a tenyészet sejtjeit hagyományos összetételű, de szacharóz kiegészítést is tartalmazó táptalajra visszük, erről nyálkatermelő mutánsokat/variánsokat izolálunk és ezeket vagy a) szacharózzal kiegészített hagyományos táptalajon közvetlenül tovább tenyésztjük, vagy b) tartósítjuk, előnyösen liofilezéssel, és tetszés szerinti időpontban a megfelelő tartósított formában visszatenyésztjük, adott esetben újabb izolálási eljárásnak vetjük alá, amelynek során adott esetben újabb típusú variánsokat is nyerünk, és az így nyert variánsokat szacharózzal kiegészített hagyományos táptalajon tovább tenyésztjük és az a) vagy b) eljárás szerinti tenyésztés folyamán termelődött nyálkát a sejtekből elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eljárásban alkalmazott akridin-típusú vegyület kinakrin, ill. ennek hidrokloridja. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Bacillus genusba tartozó törzs Bacillus megaterium, előnyösen ennek aminosavauxotróf mutánsa, előnyösen arginin- és leucin-igényes mutánsa. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a Bacillus törzset 6—20 hétig, előnyösen 6—12 hétig tenyésztjük kinakrin tartalmú táptalajban történő ismételt passzálással. 5. Az 1—4. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a táptalajban az akridin típusú vegyületet, előnyösen kinakrint vagy ennek hidrokloridját a minimális inhibitor koncentráció 1/2— 1/100 értékének megfelelő, előnyösen 5 /'g/ml koncentrációban alkalmazzuk. 6. Az 1—4. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nyálkatermelő sejtek izolálására és tenyésztésére szolgáló táptalajként 3—15 súly0,« szacharóz kiegészítést tartalmazó minimál jellegű táptalajt alkalmazunk. 5
