184406. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rögzített enzim rendszer regenerálására
1 184406 2 A találmány tárgya eljárás rögzített enzimrendszer regenerálására. Az enzim-katalizált reakciókat már viszonylag enyhe feltételek között is nagy szelektivitás jellemzi, és segítségükkel olyan feladatok is megoldhatók, amelyeket nehezen vagy egyáltalán nem lehetne megvalósítani a laboratóriumokban. Emiatt növekszik az érdeklődés az enzim-katalizált eljárások ipari megvalósítása iránt. A sok idézhető példa egyike a glükóz fruktózzá alakítása glükóz izonteráz segítségével. Az enzimek vízoldhatók és ha csak vizes oldatban kerülnek felhasználásra, visszanyerésük újrafelhasználás céljára nehézkes és viszonylag költséges. Következésképp jónéhány módszert dolgoztak ki az enzimek rögzítésére azzal a céllal, hogy akkor is számottevő aktivitást fejtsen ki az enzim, ha valamely vízben oldhatatlan hordozóhoz mereven kapcsolódik és hogy e kapcsolódás következtében az enzim újrafelhasználása számottevő ideig, számottevő nyersanyagmennyiségre lehetővé váljék. Az enzimek megkötésének egyik módját Levy és Fusee ismerteti a 4141 857 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban, ahol poliamint adszorbeáltatnak fölös mennyiségben alkalmazott kétfunkciós reagenssel, például glutáraldehiddel átitatott fém-oxidon, például alumínium-oxidon, és ily módon keresztkötéseket hoznak létre az aminban, és a keletkező polimert bezárják a fém-oxid pórusaiba, majd az anyagot enzimmel hozzák érintkezésbe, hogy az enzim amino-csoportja és a függő aldehid-csoportok között kovalens kötés jöjjön létre. A rögzített enzim-rendszerek hasznos élettartamát az enzim-aktivitás folyamatos csökkenése határolja be. Az okok, amelyek az ilyen rendszerekben az enzimek inaktiválódásához vezetnek: az enzimek mérgeződése a nyersanyag szennyezéseitől; az enzim egyéb, használat közbeni kémiai elváltozása; az enzim denaturálódása; a függő csoport és az enzim közötti kötés szétszakadása és ennek következtében az enzim oldódása; a függő csoport és a közbenső kötőréteg széthasadása; a kötőréteg elvesztése például fizikai kopással vagy a hordozóhoz kapcsoló kémiai kötés felbomlásával. Bármi legyen is az enzim inaktiválódás mechanizmusa, a rögzitett enzimrendszerek reaktiválásának lehetősége jelentős technikai fejlődést jelentene és gazdaságilag is igen kívánatos lenne. Elméletileg a reaktiválás megvalósítására két út kínálkozik. Egyik szerint magát az enzimet kellene megfiatalítani, azaz feltételezve, hogy nincs fizikai enzim-veszteség, meg lehetne fordítani azt az átalakulási folyamatot, amely az enzimet inaktívvá tette, és így az enzim visszajutna kezdeti aktív stádiumába. A másik mód‘'a rögzített enzimrendszereknek az enzim közvetlen beépítése előtti állapotát helyreállítani, hogy újra alkalmasak legyenek friss, aktív enzimek megkötésére. A két lehetőség általános alapelveit a Methods of in Enzymology szakkönyv XLIV. kötete (szerk. : Klaus Mosboch; Academic Press, 1976) tárgyalja. Találmányunk az enzimrendszereknek a beépítés előtti állapotuk helyreállításán alapul, hogy a hordozó friss enzim megkötésére alkalmas legyen. Számos módszer ismeretes az enzimeknek a hordozóról való eltávolítására. A 2537 671 számú Német Szövetségi Köztársasági nyilvánosságrahozatali irat szervetlen hordozóanyagoknak pirolízissel való regenerálását ismerteti glükóz-izomeráz rögzítésére szolgáló újabb felhasználásuk előtt. Találmányunk szerint a hordozóról az enzimet kémiai reagenssel távolitjuk el. A Biochemistry 1979, 18(22) közlemény a rögzített enzim eltávolítására enyhe kémiai kezelést javasol 1,0 mólos hidroxil-aminnal 7,0 pH-értéken tioészter-kötés felszakítása révén. Ez a módszer egy meghatározott enzim-kötés enyhe kezelésére korlátozódik. Erős bázist alkalmazó drasztikusabb módszert ismertet enzimeknek szerves hordozóról való eltávolítására * a 144559 számú Német Demokratikus Köztársaságbeli szabadalmi leírás. A leírt módszer azonban csak szerves hordozóanyagról való enzimeltávolításra vonatkozik, és nem fordít figyelmet szervetlen és szerves összetételű hordozórendszer megóvására. Továbbra is igény mutatkozik a szervetlen és szerves összetételű hordozórendszer olyan regenerálási módszerének megoldására, amely lehetővé teszi az enzim teljes eltávolítását anélkül, hogy a szervetlen és szerves összetételű hordozó szerves komponense károsodna. Találmányunk tárgya lényegében inaktiválódott, rögzített enzimrendszerek regenerálása úgy, hogy a rendszert enzimeltávolító szerrel kezeljük, az eltávolítószert elkülönítjük, a rendszert bifunkciós szerves molekulával kezeljük, amelyből függő csoportokhoz jutunk, majd a bifunkciós szerves molekula feleslegét eltávolítjuk, hogy a rendszer olyan állapotba kerüljön, amelynél friss aktív enzimet képes megkötni. Közelebbről jellemezve a találmány tárgya eljárásunk alkalmazása olyan rendszerre, amelyben a kötőréteg szerves polimer és a függő funkciós csoport-rész kovalens kötést tud képezni az enzimmel, az enzimaktivitás csökkentése nélkül. Még közelebbről jellemezve a találmány tárgya eljárásunk alkalmazása olyan esetben, amikor az enzim glükóz izomeráz és az enzimeltávolító szer sav, például sósav. Más változata az eljárás alkalmazásának, ha az eltávolítószer alkálifémhidroxid, például nátrium-hidroxid vagy kálium-hidroxid. Találmányunk további tárgyai és megvalósítási módjai nyilvánvalóak a következő leírásból. Számos rögzített enzimrendszer — mint a fent leírt is — közös elvi alapokkal rendelkezik, ahogy ezt az 1. ábra szemlélteti. Az enzimek ebben az esetben is csupán képviselői azoknak a reaktív kémiai rendszereknek, amelyek rögzíthetők és ezt követően a kémiai folyamatokban hasznosíthatók. Az A központi hordozó mag elsődleges célja a rendszer mechanikai és termikus stabilitásának biztosítása; az enzimes reakciókkal szemben kémiailag inert. A B közbenső kötőréteg köztes felületet képez a mag és a C függőcsoportok között. Ez a réteg a maghoz vagy fizikailag kötődik, például A pórusaiban bezárva, vagy erős rövid hatósugarú fizikai és/vagy kémiai erők, így felületi adszorpció vagy abszorpció által, vagy a hordozómag felületével kialakult kémiai kötéssel. A C függő csoportok a kötőréteg molekulaszerkezetének részét képezhetik vagy kémiailag kötődhetnek a kötőréteg megfelelő oldalához. Ezeket a függő csoportokat a kémiai reakcióképesség jellemzi, amely rendszerint a csoport végénél jelentkezik, és kovalens kötést tud képezni az enzim vagy más kémiai rendszer valamely olyan részével, amely kellő távolságra van az aktív helyről, és így lényegében nem befolyásolja a katalikus aktivitást. P, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
