184324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentlé szubsztrátum-koncentrációjának növelésére szteránvázas vegyületek mikrobiológiai átalakításánál
1 ! 84 324 optimális mikrobiológia; átalakításhoz szükség-:'- aiiamio szubsztráíuirs telítést tesz lehetőve. A fentiek alapján a találmány eljárás fermentlé szubsztfátum-koncentrációjának növelésére szteránvázas vegyületek mikrobiológiai átalakításánál, amely abban áll. hogy a szubsztrátumot nagy fajlagos felületű kolloid vagy durvadiszperz részecske eloszlású. 10 1 és 10 1 cm közötti átlagos részecskeátmérőjű szilárd hordozóra rögzítve juttatjuk a fermentlébe. A találmány szerinti eljárásban természetes és mesterséges szervetlen vagy szerves anyagokat alkalmazhatunk szilárd hordozóként. A szilárd részecskékkel szemben támasztott legfontosabb követelmény, hogy azok diszperzitásfoka a kolloid (10 7-10'5 cm) vagy a durvadiszperz (10_s — 10_1 cm) rendszerekre jellemző méreteknek (A. Kuhn: Kolloid Chemisches Taschenbuch, 5. Auf! . Akademische Verlaggesellschaft, Leipzig, 1960) feleljen meg. A hordozók a mikrobiológiai átalakítást önmagukban nem befolyásolhatják, azaz nem okozhatnak olyan arányú pH változást, ionleadást, ameiy a folyamatot gátolná. A fenti követelményeknek megfelelő sokféle típusú ■hordozó közül különösen előnyös hordozóként természetes eredetű vagy mesterségesen előállított aiumíniumszilikátok porát alkalmazni. Természetes eredetű alumíniumszilikátként célszerűen például agyagásványokat, mint attapulgit, kaolinit és montmorillonit vagy valamely vulkánikus eredetű obszidián - típusú ásványt, mint perlit használhatunk. Ez utóbbi típusú ásványokat felületnövelés céljából előnyös előzetesen hőkezelésnek alávetni. Mesterséges úton előállított alumíniumsziükátok közül elsősorban a különböző zeolitok jöhetnek szóba. Az alumíniunis'/.ilikátok mellett jó eicdménnycl használhatók a találmány szerinti eljárásban a lenti mérethatárok közé eső részecskenagyságú egyéb - szer vetlen vagy szerves - porok is, mint például a pirolitikus úton előállított szilíciumdioxid-por, üveg-por, ieflon-por. szója-por, cellulóz-por, A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el. hogy a mikrobiológiai eljárásban átalakítandó szteránvázas vegyület valamely szerves oldószeres oldatát folyamatosan vagy szárítás közbeiktatásával részletekben a folytonosan mozgatott hordozó felületére permetezzük, s az így kapott anyagot az oldószer elpárologtatása után a fermentlébe adagoljuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Igen nagy mennyiségű szubsztrát adagolását teszi lehetővé, ugyanakkor meggyorsítja a fermentlében a szubsztrátum-telítődést, sőt alkalmazása túltelített oldat keletkezéséhez vezet. b) A hordozók hővel steriiezhetők, és meggátolják a rájuk felhordott anyag összetapadását. c) A hordozókon rögzített anyag sem a sterilezés. sem az átalakítás során nem okoz habzást. A feldolgozást nem zavarja sem emulzió-képződéssel, sem az extraktum szennyezésével, sem a szűrhetőség rontásával, sőt az utóbbit előnyösen befolyásolja. d) Alkalmazható nyerstermék szubsztrátumok adagolásakor is, amikor az anyagok nukronizált eloszlását az esetleg jelenlevő olajok, lipoidok egyébként gátolják. e) A szteránvázas vegyúletek mindenféle mikrobiológiai átalakításánál, hidroxiíezésnél. dehidrogénezésnél. oldalláncbontásnál, hidrolízisnél egyaránt alkalmazható, függetlenül az átalakítást végző mikroorganizmustól. A találmány szerinti eljárás szemléltetésére szolgáló példáinkban aszeptikus, lázoit lombikos vagy fermentoros süllyesztett tenyésztési körülményeket alkalmazunk. Rázott lombikos körülményeket 500 mí-es Erlenmeyer lombikban 100 ml fermenííét percenként 300 fordulatszámú, 2.5 cm kilengésű síkrázógépen - megfelelő hőmérsékletű szobában - rázatva állítunk elő Fermentoros körülményeket - 5 liter fetmentié számára - változtatható percenkénti fordulatszámma! kevertethető. ill. percenkénti levegőmennyiséggel átáramoltatható vízfürdőben termosztált 10 literes laboratóriumi fermentorban alkalmazunk. Inokulum készítéshez a rázott lombikokat burgonyásdextrózos ferdeagaron növesztett 2-3 hetes tenyészetről 10 ml steril vízzel készített ún. csőszuszpenzió 1 ! m!-éve! oltjuk. Fermentációhoz rázott lombikokat 5-5 ml, fermentorokat 300—300 ml 2 napos inokulum rázott tenyészettel oltunk. A fermentációk befejezésekor a fermenileveket szerves oldószerrel extraháljuk. A mikrobiológiai átalakítások eredményének meghatározását az extraktumból a termék preparatív vékonyréteg-kromatográfiás kinyerésével, a konverzió kvantitatív vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatával, androszt-4-én-3,17-dion esetén E. Cingolani, G. Cavina és V Amormin'.' [Farmaco, Ed. Prat. 15, 301 (I960)] izonikotinsavhidrazidos módszerével, vagy a termék kinyerésével; szívglukozidok esetén pedig a 176 249 sz. magyar szabadalmi leírásban közölt dixantilkarbamidos módszerrel végeztük. A vékonyréteg kromatográfiás vizsgálatokat az alábbiakban ismertetjük. Preparatív vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat: A fermentlé extraktuniának szárazmaradekát szerves oldószerben oldjuk. 1 mm vastagságú vékonyidteg lapon (Kieselgel HF-254 Merck. Darmstadt. Német Szövetségi Köztársaság) 50 100 mg anyagkeveréket választunk szét a megfelelő futtatórendszerben. A terméket tartalmazó sávrészt a lemezről lekaparjuk és szerves oldószerrel eluáljuk. Az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk, majd méljük a termék súlyát. Kvantitatív vékonyréteg-kromatogiáfiás vizsgálat: A fermentlé megfelelő' extraktuniának mért hányadából annyit cseppentünk fel Kieselgel HF-254 0,25 mm vastagság'! rétegére, amennyi a meghatározandó anyagból 20-100 ng-ot tartalmaz. Ezután a lemezt a megfelelő rendszerben futtatjuk, a réteget megszárítjuk, a mérendő anyagok foltját ultraibolya fényben kijelöljük, majd a foltokat csiszoltdugós kémcsövekbe kaparjuk. Az adszorbensről a szteroidokat 10 ml 96 57-os etanollal ieoldjuk. és az eluátum extinkcióját 242 nm-nél mérjük. Standard görbéről leolvassuk az oldat szteroid-lartalmát. s ennek segítségével kiszámítjuk a fermentlé szteroid-tartalmát A kiviteli példákban leggyakrabban szereplő inokulum. illetve fermentációs táptalajok összetételét az alábbiakban adjuk meg. 2 5 5 /e!ü tápralai: 0.3 aszparagin 0.05 7c dikáliuin-hidrogén-toszfát 0.05 7r magnézium-szulfát 0.005 7c vas( III )-ammónium-citrát 0.2 7c citromsav 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
