184256. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellenes hatású antibiotikum komplexek előállítására

1

184 256

2

Megjegyezzük, hogy a jelen szabadalmi leírás szerint a BBM-928 termelése nem korlátozódik a fenti növekedési és mikroszkópos jellemzőkkel leírt G455-101 jelű, kiválasztott Aktinomyces törzsre. A fenti jellemzőket csak bemutatás céljából adtuk meg, és a találmány szerinti eljárásban a fent leírt organizmusból ismert módokon készített, a BBM—928 komplex vagy egyes komponenseinek termelésére képes törzseket vagy mutánsokat is alkalmaztunk. (Az ismert módok: röntgen és ultraibolya besugárzás, nitrogén-mustár, fággal való fertőzés és hasonlók.)

A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint a rákellenes hatású BBM-928 komplex előállítására a G455-101 jelű Aktinomyces törzset emészthető szén- és nitrogén-forrást tartalmazó vizes oldatban, süllyesztett, levegőztetett fermentációs körülmények között addig tenyésztjük, míg az említett oldatban a kívánt rákellenes aktivitás mérhető. A G455-101 számú Aktinomyces törzs tenyésztésére a bevált fermentációs módszereket alkalmazzuk. A jelen találmány szerinti antibiotikus, rákellenes hatású anyag termelésére használt táptalaj olyan emészthető szénforrást tartalmaz, mint például a keményítő, dextrin, maltóz, laktóz, szacharóz, fruktóz, mannóz, melasz, glicerin és hasonlók. A táptalaj tartalmazhat még emészthető nitrogén-forrásként fehérjét, fehérje-hidrolizátumot, polipeptideket, aminosavakat, kukoricalekvárt, kazeint, karbamidot és hasonlókat, valamint szervetlen tápsókat, szervetlen anionokat és kationokat, mint például kálium-, nátrium-, ammonium-, kalcium-, szulfát-, karbonát, foszfát-, klorid-, nitrát-ion és hasonlók. A BBM-928 komplex termeléséhez bármely, az organizmus kielégítő növekedését elősegítő hőmérséklet használható. A körülbelül 20°C-tól 15 °C-ig terjedő hőmérséklet-tartomány alkalmazható, előnyös az organizmus növekedéséhez optimális 28 °C-tól 34 °C-ig terjedő tartomány, legelőnyösebb a 30-32 °C-os hőmérséklet.

A BBM-928 komplex maximális koncentrációját általában 4-6 nap alatt érjük el. A fermentációs periódusban a bevált módszereket használjuk. Például kis mennyiségek előállítására előnyösen használhatjuk a rázott lombikos vagy felületi tenyészetet. Nagyobb mennyiségek előállítására előnyösen használhatjuk a süllyesztett, levegőztetett tenyésztést, steril tankban. Tank-fermentáció esetén először vegetatív oltóanyagot állítunk elő, a táptalajt beoltjuk az organizmus spórájával, hogy fiatal, aktív oltóanyagot nyerjünk, ezt sterilen átoltjuk a fermentorban lévő táptalajba. A tankban, illetve az üvegekben a levegőztetést úgy biztosítjuk, hogy steril levegőt áramoltatunk át a táptalajon, vagy a táptalaj felületére juttatjuk, és a táptalajt mechanikusan keverjük. Szükség esetén habgátló anyagokat adagolhatunk, mint például szójaolajat, szilikonolajat és disznózsírt.

A fermentációs táptalaj, vagy a BBM-928 komplex kivonatai antibiotikum-tartalmát a papírkorong agar-diffúziós módszerrel határozzuk meg Sarcina luteát alkalmazva vizsgáló organizmusként és tápagart használva vizsgáló táptalajként. A táptalaj hatóanyag-tartalmának meghatározásához a pH-t 9,0-re állítjuk be, hogy a mérőrendszer optimális érzékenységét biztosítjuk.

A BBM-928 komplexet olyan bevált módszerekkel izoláljuk a fermentléből, mint az oldószeres extrakciós eljárások. A BBM-928 A, B, C, D, E és F komponensek előállítására a tisztítást előnyösen preparatív ellenáramú

megoszlási és kromatográfiás módszerekkel végezzük, mint ahogy azt a 2. és 3. példában részletesen ismertetjük. A BBM-928 egyes komponenseinek oldhatósága és színreakciói hasonlók egymáshoz. Például jól oldódnak kloroformban és diklórmetánban, gyengén oldódnak benzolban, etanolban, metanolban^s n-butanolban, valamint oldhatatlanok vízben és n-hexánban. Vas(III)-kloriddal és Ehrlich-reagenssel pozitív reakciót adnak, míg a Tollens- és Sakaguchi-reagensekkel, valamint ninhidrinnel nem reagálnak. A 3. példa szerinti BBM-928 komponensek fizikai-kémiai tulajdonságait a 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

A BBM-928 A, B, C és D komponensek fizikai-kémiai tulajdonságai

BBM-928

A

B

C

D

Olvadáspont, °C

l«lfe5

246-248

214-217

244- 248

224-227

(1% kloroform)-27°-74°-91°-13°

Elemanalízis C:

53,19

50,14

51,77

50,75

H-.

5,40

5,29

5,29

5,25

N:

12,92

12,34

13,55

12,58

(különbségből) O:

28,49

32,23

29,39

31,42

*max. nm-ben

235(586) '

235(570)

235(638)

235(550)

(V1% )

^1 cm'

264(415)

264(400)

264(442)

264(380)

etanolban

345(165)

345(163)

345(173)

345(155)

sósavas etanolban

234(610)

234(556)

234(650)

234(565)

264(410)

264(446)

264(442)

264(405)

345(165)

345(188)

345(173)

345(165)

nátrium-hidroxidos

230(564)

230(530)

230(580)

230(650)

etanolban

256(763)

256(775)

256(704)

256(930)

330(180)

330(116)

330(117)

330(140)

Molekulasúly

(Ozmométer,

383(170)

383(122)

383(122)

383(145)

kloroformban)

1,450-1,470-Az A, B, C és D komponensek infravörös (IR) spektrumát az 1-4. ábrán láthatjuk, mágneses magrezonancia spektrumát az 5—8. ábrán láthatjuk. A BBM-928 A (5. ábra), a BBM-928 B (6. ábra) és a BBM-928 C (7. ábra) mágneses magrezonancia spektruma nagyon hasonló, az egyetlen különbség az, hogy az A komponensben (6:

2,03 ppm, 2 mól ekvivalens) és a B komponensben (Ô:

2,05 ppm, 1 mól ekvivalens) acetilcsoport van jelen, míg a C-ben nincs. Piridinben ecetsav-anhidriddel acetilezve 2, 3 çs 4 mól ekvivalens acetilcsoportot vittünk be a BBM-928 A, B és C komponenseibe. Az így kapott három acetilezett termék azonos vékonyréteg-kromatográfiás tulajdonságokat, valamint azonos ultraibolya, infravörös és mágneses magrezonancia spektrumokat mutatott, jelezve, hogy a BBM-928 mono-acetil-származéka a BBM-928 B-nek és diacetil-származéka a BBM-928 C-nek. A BBM-928 A savas hierolizátumában öt n-butanolban oldódó ultraibolya elnyelő fragmenst (I, II, III, IV és V) és öt vízben oldódó, ninhidrin-pozitív anyagot (NPS-1, 2, 3, 4 és 5) találtunk. Az utóbbi anyagokat Dowex 50X4 gyantán kromatografálva elválasztottuk, és a következő aminosavakként azonosítottuk:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4