184229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunszabályozó hatású polimervegyületek előállítására
1 184 229 2 Ismeretes, hogy az etilén-maleinsav-anhidrid kopolimerek amid-származékait előállíthatjuk oly módon, hogy a kopolimert szobahőmérsékleten vagy magasabb hőmérsékleten ammóniagázzal reagáltatjuk (lásd például a 664 326 számú kanadai szabadalmi leírást és a 2 883 287 és a 3 157 595 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Ismeretes az is, hogy ha a reakciót magasabb hőmérsékleten végezzük, úgy több imid-csoport keletkezik, míg az imid-csoportok kialakulásának gátlására nem reakcióképes szerves folyékony halmazállapotú oldószert, például benzolt használunk, és ugyanezért szabályozzuk a hőmérsékletet. Az amid-képzés ismert módszere szerint a polimert folyékony halmazállapotú ammóniával reagáltatjuk -33 °C hőmérsékleten. A fenti eljárások általánosan használhatók az imidcsoportokat tartalmazó származékok előállításakor köztes vegyületként használható félamid, félammónium-sók képzésekor, az ammónia tökéletesen diffundál az etilénmaleinsav-anhidrid kopolimer részecskék belső részeibe is, ahogy az a 2. példában megadottakból következik. A találmány szerinti eljárás előnyös kivitelezési változata szerint úgy járunk el, hogy az etilén-maleinsav-anhidrid típusú kopolimert acetonban oldjuk, majd az oldott polimert acetonban folyékony ammóniával reagáltatjuk. Az előállítani szándékolt félamid, félammónium-só termék kiválik az oldatból, és ezt követően szűréssel, centrifugálással vagy más ismert módszerrel a 2. példa a., b. és c. pontja szerint könnyen elkülöníthetjük. A mellékelt 2. ábrán bemutatjuk a 2a. példában megadottak szerint előállított félamid, félammónium-só termék infravörös abszorpciós spektrumát, a termék 0% imidet tartalmaz. Az előnyös, imidcsoportokat tartalmazó származék előállítására ezután a köztes félamid, félammónium-sót tovább reagáltatjuk ammóniával, amikor az mind az a. félamid, félammónium-só csoportokat, mind pedig a b. imidcsoportokat tartalmazni fogja oly módon, hogy az imidcsoportok a származtatott csoportok 5 % és 40% közötti mennyiségét képviselik. Adott esetben a félammónium-sócsoportokat más, gyógyszerészeti szempontból elfogadható sócsoportokká alakíthatjuk át. A reakciót előnyös oldószerrel készült reakcióelegyben, például toluolban vagy xilolban végezzük, a reakcióelegy forráspontjának megfelelő hőmérsékleten, mindaddig, míg a szükséges mennyiségű imidcsoport kialakul. Ezt az eljárást a későbbiekben a 3. és a 4. példában ismertetjük. A reakcióelegy forráspontja 50 °C és 200 °C, előnyösen 60 °C és 150 °C, legelőnyösebben 100 °C és 150 °C között változhat. A mellékelt ábrák közül az 1. ábrán bemutatjuk a 3. példa 4. táblázatának 5. kísérlete szerint előállított, mind a. félamid, félammónium-só funkciós csoportokat, mind pedig b. imidcsoportokat, ez utóbbit 20%-ban tartalmazó polimer infravörös abszorpciós spektrumát. A példa szerinti polimer átlagos molekulasúlya 850 és a 20% imidtartalom az előnyös 10% és 25% közé esik. Az összehasonlítás érdekében előállítjuk az 5. példában a 100% imidcsoportot tartalmazó etilén-maleinsavanhidrid kopolimert. A mellékelt 3. ábrán megadjuk ezen termék infravörös abszorpciós spektrumát. Az 1. példában részletesen ismertetjük az 1-3. ábrák infravörös abszorpciós spektrumainak analízisét. A találmány szerinti polimerek rákterápiában felhasználható immunszabályozó hatását jellemző polimer termékekkel az alábbi vizsgálatokkal bizonyítjuk. 4 Az első kísérletsor folyamán a polimereket vírus által indukált nem metastázisos egérdaganaton vizsgáljuk. Modellként SG40-vírus által indukált fibroszarkomát választunk (m KSA), amely BALB/C egér eredetű. Ezt az m KSA-TU5 daganatot Kit és munkatársai írják le [Int. J. Cancer, 4, 384-392, 1969], és nem gyengül a BALB/C egérben. A kísérletek során a megfigyelt daganatregresszió Összefüggőt az immunstimulálással és a daganat súlyának csökkenésévi, jól egyezve Dean és munkatársai [Int. J. Cancer, 16. 465—475,1975] adataival, akik kimutatták, hogy az m KSA daganattal antigének jelennek meg, továbbá, hogy a kis daganatokat hordozó állatokban jó korreláció figyelhető meg a sejttől függő immunitással. Az egereket különböző mennyiségű vizsgált vegyülettel kezeltük az életképes tumorsejtekkel való fertőzés előtt vagy után, vagy előtt is és után is (TD10o és TDS0). Ezután összehasonlítottuk a tumorok növekedését a nem kezelt kontroll állatok tumorjainak növekedésével. Ezen kísérletek során a 850 molekulasúlyú találmány szerinti polimerek jóval nagyobb daganatregressziót váltottak ki, mint a 2000— 3000 és a 20 000-50 000 közötti molekulasúlyú polimerek. Egy másik kísérlet során a találmány szerinti polimereket kémiailag indukált metastázisos patkánydaganaton vizsgáltuk. Modellként a 3-metil-kolantrénnel indukált hólyagdaganatot (BLCA) használtuk Fisher 344 patkányokban [lásd Prehn és munkatársai, J. Nat. Can. Inst., 18. 769, 1957; és Falk és munkatársai, Surgery, 1978. október]. A daganatsejteket sejtkultúrában tartjuk fent 5 év óta. Szubkután beültetést követően egy héten belül metastázisos állapotba kerül a tüdő. A szubkután tumorbeültetést követően a szokásos túlélési idő három hét vagy kevesebb. A metastázisos patkánydaganat modellel végzett kísérlet egyik részében a vizsgált polimert a tumor beültetését követően hetenként három héten át szakaszosan adagoltuk. Ezeknek a kezelt állatoknak több mint háromszor hosszabb volt a túlélési idejük, mint a nem kezelt kontroll állatoké és a hat hetes megfigyelési időszakban metastázis nem volt megfigyelhető. A fenti kísérlet egy másik részében a vizsgált polimert a daganat beültetését követő 7-10. napon a tumor kivágásakor adagoltuk. A kezelt állatokat megfigyeltük, hogy a daganat újra jelentkezik-e és az eredményeket a nem kezelt kontroll állatokkal összehasonlítottuk. A kontroll állatokban a tumor újramegjelenése a tumor kivágását követően hat héten belül, átlagosan 32 napon belül 100%-osan újra megjelent, míg a találmány szerinti előnyös polimer testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségével kezelt állatokban az első hat héten tumor nem jelent meg, a 10. hét után a tumor csak az állatok 13 %-ában jelentkezett újra. Egy további kísérletsorozat során a találmány szerinti jellemző polimereket közönséges Lewis törzsbe tartozó patkányokon vizsgáltuk, és kimutattuk, hogy stimulálják az immunválaszt, amit a megnövekedett antitest-termelés bizonyított. A közönséges Lewis patkányokkal végzett másik kísérlet során kimutattuk a találmány szerinti polimerek B-sejt-aktiválását, anélkül, hogy T-sejtek megjelentek volna, ami azt jelenti, hogy a polimerek a csecsemőmirigy funkcióját pótolják. A T-sejtek csecsemőmirigymeghatározott limfociták, ugyanakkor a B-sejtek olyan 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
