184227. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imidazolszármazékok előállítására
1 184 227 2 szintetáz enzimre, valamint a prosztaciklin-szintetáz és ciklo-oxigenáz enzimekre gyakorolt hatását a következő in vitro enzim-próbákkal határoztuk meg: 1. Ciklo-oxigenáz Kos-ondóhólyagból izolált mikroszómákat [Biochemistry 10, 2372 (1971)] arachidonsawal inkubálva (100 mikromól, 1 perc, 22 °C) PGH2-t állítunk elő, és a reakciókeverék alikvotjait 37 °C-on Krebs-bikarbonátpuffer áramába [amely antagonisták (Nature 218, 1135 (1968)] és indometacin [Brit. J. Pharmacol. 45, 451 (1972)] keverékét tartalmazza] fecskendezzük. E folyadékáramot csavarvonalalakúra vágott nyúlaorta-csíkra bocsátjuk rá [Nature, 223, 29 (1969)]. Egy vegyidet enzimgátló képességét úgy határozzuk meg, hogy megmérjük a PGH2 -okozta izometrikus tenzió fokozódását a vizsgálandó vegyület távollétében, majd az enzimet a vizsgálandó vegyülettel 5 percig előinkubálva, és a kapott értékeket összevetjük. 2. Prosztaciklin (PGI2 j-szintetáz Sertés-aorta mikroszómákat [Nature 263, 663(1976)] a fenti 1. pont szerint nyert PGH2-vel inkubálunk (30 másodperc, 22 C) és a reakciókeverék alikvotjaival elvégezzük az 1. pontban leírt próbát. A PGI2 -képződést közvetett módon értékeljük a PGH2-okozta tenziócsökkenés mérése útján (a PGI2 maga nem húzza össze az aortát). E csökkenés teljesen kivédhető, ha az enzimet szelektív PGI2-szintetáz-inhibitorral, 15-hidroperoxi-arachidonsawal előinkubáljuk [Prostaglandins 12, 715 (1976)]. Ezután a vizsgálandó vegyületet az enzimmel 5 percig előinkubáljuk és megmérjük a tenziócsökkenést gátló képességét. 3 3. Tromboxán A2 (TxA2)-szintetáz Emberi vérlemezke-mikroszómákkal előkezelt indometacint [Science 193, 163 (1976)] PGH2-vel (az 1. pont szerint előállítva) inkubálunk (2 perc, 0 C) és a reakciókeverék alikvotjait két, egymástól elválasztótekerccsel elkülönített nyúlaorta-csíkra bocsátjuk rá (2 perc). Az elválasztó tekercset azért alkalmazzuk, hogy a kevésbé stabil tromboxán A2 bomlása szelektíven mehessen végbe [Proc. Nat. Acad, Sei. 72, 2994(1975)] és így külön mérhessük a képződött TxA2-nek és a maradék PGH2-nek tulajdonítható izometrikus tenziófokozódást. A vizsgálandó vegyületet az enzimmel 5 percig előinkubáljuk és tromboxán-szintetázt gátló képességét az izometrikus tenzió TxA2-összetevőjének csökkenéséből határozzuk meg. Az így kipróbált találmány szerinti vegyületek képesek a tromboxán-szintetáz enzim szelektív gátlására. E próbák eredményei a következő táblázatban láthatók, ahol az egyes vegyületek azon mólkoncentrációit adtuk meg, melyek a feltüntetett enzimeknek az izometrikus tenzióra gyakorolt hatásában 50%-os változást idéznek elő, azaz az enzimhatás 50%-os gátlását okozzák. 4 50%-os gátlást előidéző mólkoncentráció Példa száma (1) tromboxán - -szintetáz (2) ciklo- (3) prosztaciklin-oxigenáz -szintetáz 2 8,2X10-9 >10-4 >10"4 4 2,4X10-9 >10-4 5 4,7X10“8 >10~4 7 1,0X10-11 8 4,6X10“8 >10"4 24 4,5X10-9 A táblázatban megadott eredmények azt mutatják, hogy minden vizsgált vegyület 50%-osan gátolja a tromboxán-szintetáz enzimet, 1,0X10-S vagy ennél kisebb mólkoncentrációban. Számos vegyület okoz 50% os gátlást 10~8 vagy ennél kisebb mólkoncentrációban. A ciklo-oxigenáz enzim gátlására vizsgált vegyületek közül egyik sem okozott 50%-os gátlást 10-4 vagy ennél kisebb mólkoncentrációban. így a ciklo-oxigenáz enzimet gátló képességük legalább 2100-szor kisebb a tromboxán-szintetáz enzimet gátló képességüknél. A prosztaciklin-szintetáz enzim gátlására vizsgált vegyületek közül egyik sem okozott 50%-os gátlást olyan mólkoncentráció alatt, amely ne lett volna 2000-szer nagyobb a tromboxán-szintetáz 50%-os gátlását előidéző mólkoncentrációnál, azaz e vegyületek valamennyien legalább 2000-szer hatásosabban gátolják a tromboxánszintetázt, mint a prosztaciklin-szintetázt. Várható, hogy ha valamennyi találmány szerinti vegyületet a fenti módon megvizsgálunk, az eredmények bele fognak esni a már kipróbált vegyületekkel kapott eredmények tartományába. A fentieken kívül leírtak egy in vitro próbát emberi vériemézke-aggregáció gátlásának mérésére, melynek alapján előrelátható a klinikailag hatásos trombózisgátló aktivitás [Lancet (ü) 1223 (1974); J. Exp. Med. 126, 171 (1967)]. E próbában a klinikailag hatásos aszpirin és szulfmpirazon in vitro gátló hatást fejt ki számos aggregáló hatású szerrel szemben Állatoknál számos in vivo tesztet is leírtak a hatásos trombózisgátló szerek értékelésére. Arachidonsav intravénás injekciója vérlemezke-összetapadást és tüdőembóliát okozva nyúlnál halált okoz. A klinikailag hatásos aszpirin [Agents and Actions 1, 481 (1977)] és szulfmpirazon [Pharmacology 14, 522 (1976)] megvédi a nyulat az injekció halálos hatásától. A szulfinpirazonról azt is kimutatták, hogy patkánynál in vivo gátolja a vérlemezke-aggregációt a testből kivezetett hasi aortakacsban [Thromb. Diathes. Haem. 30, 138 (1973)]. E vegyületek orálisan alkalmazhatók a vegyület egységdózisát kötőanyagokkal, mint kukoricakeményítővel, kalcium-karbonáttal, dikalcium-foszfáttal, alginsawal, laktózzal, magnézium-sztearáttal, „Primogel”-lel (védjegyzett név) vagy talkummal együtt tartalmazó tabletták vagy kapszulák alakjában. Áz utóbbiakat jellemzően úgy állítjuk elő, hogy az alkotórészeket együtt megőröljük és megfelelő méretű kemény zselatinkapszulákba töltjük. A vegyületek parenterálisan is alkalmazhatók, például intramuszkuláris, intravénás vagy szubkután injekciók formájában. Parenterális alkalmazáshoz legelőnyösebben olyan steril vizes oldat alakjában használjuk őket, amely 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
