184125. lajstromszámú szabadalom • Új genetikai eljárás antibiotikumot termelő micromonospóra törzsek előállítására
184 125 A találmány tárgya eljárás antibiotikum-termelő Micromonospora törzsek megváltozott genetikai állományú egyedeinek előállítására. Ismeretes, hogy az antibiotikum-termelés genetikailag determinált, és így a termelő törzs genetikai állományában történt változás az antibiotikum-termelő képességet is befolyásolja. Ezek a stabil genetikai változások (mutációk) rendkívül kis gyakorisággal spontán is előfordulnak. A mutációk gyakoriságát az ismert módszerekkel UV-, közeli UV-, gamma-és Röntgen-besugárzással, valamint különböző mutagén anyagokkal történő kezeléssel fokozni lehet. Ezeket az eljárásokat sikeresen alkalmazták különböző törzsek esetében az antibiotikum-termelő képesség fokozására. A módszer hátránya, hogy az indukált mutáció nem irányítható, azaz véletlen folyamat, valamint, hogy a mutációs kezelést túlélők nem mindegyike mutáns. így igen nagyszámú túlélőt kell átvizsgálni, míg egy jobban termelő mutánst kapnak. Ismeretes, hogy igen sok enzim szintje megemelkedik a géndózis emelkedésével, azaz ha egy gén megkétszereződik az adott kromoszómán belül, az általa kódolt fehérjének a szintje is kb. a kétszeresére nő. Ismeretes továbbá, hogy az antibiotikumok szintéziséért felelős enzimek szintjének az emelése fokozza az illető antibiotikum szintézisét. A génduplikáció mechanizmusa nem tisztázott .Ugyanúgy az sem ismeretes, hogy melyik mutagén anyag okoz elsősorban génduplikációt. A fentiek alapján érthető, hogy egy olyan eljárás, amely jelentősen fokozza a génduplikációk számát nagy jelentőségű az antibiotikum-termelő törzsek termelésének fokozásában. Iparilag hasznos lehet hasonló antibiotikumokat termelő két Micromonospora fajból olyan új faj előállítása, mely a kiindulási törzseknél kedvezőbb tenyésztési vagy termelési tulajdonságokkal rendelkezik, vagy a kiindulási törzsek által termelt antibiotikumokkal rokonszerkezetű, új, értékes antibiotikumot termel. A protoplaszt-fúziós módszer megoldást ad a fenti problémákra. A találmány célja, hogy lehetővé tegye a Micromonospora törzsek genetikai tulajdonságainak előnyös megváltoztatását a rekombináció útján. Az iparilag fontos Micromonospora genusnál — egyetlen közleménytől eltekintve [Beretta et. al. J. of. Bact. 107, 415 (1971)] - nem ismert semilyen genetikai információátviteli módszer. A Streptomycetáknál elírt 10‘6-os rekombinációs gyakorisággal szemben a Micromonospora törzseknél klasszikus módszerekkel egyáltalán nem kaptunk rekombinánsokat, míg az úgyanezekre a törzsekre kidolgozott protolaszt-fúziós módszerrel 10'3 —10'4-es gyakorisággal tudtuk megvalósítani a genetikai információátvitelt. A protoplasztok fúziója során két vagy több proto-, plaszt teljes citoplazmája és így az abban lévő teljes genetikai állomány egyesül. A szelekció során vagy stabil merodiploidokat vagy rekombinánsokat kapunk. A merodiploidok esetében az antibiotikum szintézisért felelős gének száma a sejten belül megnőhet még akkor is, ha nem közvetlenül az antibiotikum termelésre szelektálunk. A rekombináció alatt is felléphet génduplikáció. 3 Előnye még a módszernek, hogy a protoplasztfúzió során a szelekciót túlélőkben sokkal nagyobb gyakorisággal rögzítődnek a donorból a recipiensbe került nagy kromoszóma darabok, mint bármely más, a baktériumgenetikában eddig alkalmazott módszer esetében. A protoplaszt-fúziós módszert régóta kiterjedten alkalmazzák emlős és növényi sejtek, valamint gombák genetikai tulajdonságainak vizsgálatánál. Baktérium-protoplasztok fúziójáról a sejtfal-regenerálás nehézségei miatt 1976-ban jelentek meg az első közlemények: K. Fodor és L. Alföldi: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 2147 (1976); P. Schaeffer et al.: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73, 2151 (1976); D. A. Hopwood et al.: Nature 268, 171 (1977); R. H. Baltz: J. of Gen. Microb. 107, 93 (1978); 0. Godfrey et al.: Can. J. Microbiol. 24, 904 (1978). A Micromonospora családon belüli sikeres protoplasztfúzióról a szakirodalomban nem jelent meg közlemény. A találmány tárgya eljárás megváltoztatott genetikai állományú antibiotikum-termelő Micromonospora törzsek előállítására, amely abban áll, hogy antibiotikumot termelő Micromonospora törzsek két mutánsának - melyek közül legalább az egyik genetikailag jelzett — tenyészeteiből glicines táptalajban történő tenyésztés után, előnyösen szacharózzal biztosított ozmotikus védelem mellett, lizozim enzimmel protoplaszt szuszpenziót készítünk, az így kapott két szuszpenziót polietilénglikol jelenlétében elegyítjük és szobahőmérsékleten inkubáljuk. A kapott fúzionált protoplasztokat lágy agárban szuszpendálva előnyösen szacharózt, prolint és szervetlen sókat tartalmazó agarlemezre rétegezzük, 20—30 napig inkubáljuk, majd a regenerálódott telepek közül kiválasztjuk azokat, amelyek genetikai állománya biztosan eltér a szülőkétől. A sejtfal lizozimes leoldásának elősegítéséhez előnyösen 0,2—0,5 % glicint adagolunk a tenyésztő táptalajba. A glicin sejtfal-bioszintézist gátló hatása folytán a glicinnel érzékenyített tenyészetek közös jellegzetessége, hogy a micélium-fonalak rövidebbek és vastagabbak mint a glicint nem tartalmazó tenyészetekben, és kidudorodások jelennek meg rajtuk. Csak az ilyen mikroszkópos képet mutató tenyészetekből készíthető kielégítő hatásfokkal protoplaszt szuszpenzió. Az érzékenyített tenyészeteket ozmotikus védelem mellett (célszerűen 0,2-0,35 M szacharózt tartalmazó közegben) 5-10 mg/ml koncentrációjú lizozim enzimmel 30—90 percig kezeljük. A törzsek különböző mutánsaiból kapott protoplaszt szuszpenziókat 1:1 arányban keverve és 6000-es mólsúlyú polietilénglikollal kezelve a protoplasztok fuzionálnak. A fúzionált protoplasztokat tartalmazó szuszpenziót regeneráló agaron, amely az ozmotikus védelemhez szükséges szacharózt, a regenerálást elősegítő prolint és szervetlen sókat, előnyösen kálcium(II)-kloridot, magnézium(Il)-kloridot, kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmaz, 30-37 C° hőfokhatárok között inkubáljuk. A protoplasztok 20-30 nap alatt regenerálódnak. A kiválasztott szülőpárok genetikai tulajdonságainak ofyannak kell lenniük, hogy belőlük a fúzió során kelet4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
