183675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az oxitocin tisztítására
183 675 2 Példa a) 150 g (113 mmol) Z-Cys(Bzl)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2-ot ismert módon redukálunk fémnátriummal cseppfolyós ammóniában. Az ammónia elpárologtatása után a maradékot 20 1 ionmentes vízben oldjuk, és az oldatot kb. 500 g H+-ciklusú Sephadex C-25 (Pharmacia) gyantával ioncseréljük pH 8—9-re. A gyanta kiszűrése után a szürletet 120 1-re hígítjuk ionmentes vízzel, kémhatását ecetsavval pH 6,5—6,7-re állítjuk, majd hidrogén-peroxid jelenlétében a szokásos módon (151 959 számú magyar szabadalmi leírás) végezzük az oxidációt levegőátbuborékoltatással. Az így kapott nyers oxitocin oldat összesen 35—36 millió NE oxitocint tartalmaz biológiai értékmérés alapján. b) A nyers oxitocinoldatot vákuumban 40 °C hőmérsékletű vízfürdőn 2,0—2,5 1-re betöményítjük, kémhatását ecetsavval pH 5,4-re állítjuk, majd a nem oldódó csapadékot szűréssel eltávolítjuk és a szürletet az alábbi módon elkészített oszlopra visszük. 3,6 kg H+-ciklusú CM-Sephadcx C-25 gyantát 48 órán keresztül 0,1 mol/l koncentrációjú, 5,4 pH-értékű ammónium-acetát-oldatban duzzasztunk. A szuszpenziót betöltjük egy 215 mm átmérőjű, 1000 mm hosszú K 215/100 Pharmacia oszlopba, és a tölteten 2 órán keresztül a fenti pufferoldatot áramoltatjuk Braun und Lübbe (Salzburg) N-SM 31 típusú szabályozható sebességű adagolószivattyúval. Az így egyensúlyba hozott oszlopra felvisszük a fenti oxitocinoldatot, és az eluciót 20 órán keresztül végezzük a fenti pufferoldattal 3,6 1/óra áramlási sebességgel. Az oldat elnyelését 280 nm-en detektáljuk LKB Uvicord II típusú átfolyásos küvettás fotométeren. A 15 perces időközökben szedett frakciókból az elnyelési görbe alapján gyűjtjük össze a tiszta oxilocint tartalmazókat.. Ezeket homogenizáljuk, majd vagy oldatként használjuk fel a kapott alakban, vagy hígítás után injekciós készítmények gyártására alkalmazzuk őket, vagy pedig liofilizálva port készítünk belőlük. Ha a liofilizálás előtt számított mennyiségű 5 szerves savat adunk az oldathoz, úgy a liofilizált oxitocint a megfelelő só alakjában kapjuk. A fenti mennyiségű nyers szintetikus oxitocinból a tisztítás során összesen 32 millió NE oxitocint kapunk. Ebből liofilizálással 71—80 g (400—450 10 NE/mg) légszáraz oxitocin állítható elő, amelynek peptidtartalma 80—90% (a tirozintartalom spektrofotometriás meghatározása alapján). A többi víz és ammónium-acetát, amelyek mennyiségét gázkromatográfiásán lehet meghatározni, az utóbbit ecetsav 15 alakjában. Nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint a liofilizátum legfeljebb 3% egyéb pepiidet tartalmaz az oxitocin mellett. A termék fajlagos forgatóképessége a peptidtartalomtól függően [ar]t>4 =—24,6—27,2° (c = 0,49, 1 mol/l ecetsav), ami 20 jól megegyezik az irodalmi adatokkal. Szabadalmi igénypont 25 Eljárás szintetikusan előállított nyers oxitocin tisztítására, azzal jellemezve, hogy a szintézis utolsó kémiai művelete előtt már ioncserével tisztított oxitocin oldatát kationcserélő gyantából — előnyösen gyengén 30 savanyú, karboximetil-csoporttal módosított, térhálósított dextrán-gyantából — készített oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 5 és 6 közötti, előnyösen 4,4 pH-értékű, 0,05—0,25 mol/l — előnyösen 0,1 mol/l — koncentrációjú ammóniumacetát-oldattal 35 egyensúlyba hoztunk, majd az oxitocint ugyanezen oldattal eluáljuk és kívánt esetben az oszlopot ugyanezzel az oldattal történő mosással regeneráljuk. ábra nincs Kiadja a?. Országos Találmányi Hivatal A kiadásért l'elel: Himer Zoltán osztályvezető Megjelent a Műszaki Könyvkiadó gondozásában 86-675 — Szegedi Nyomda
