183675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az oxitocin tisztítására
183 675 2 A találmány tárgya eljárás a szintetikus oxitoein tisztítására. Az ember- és állatgyógyászatban egyaránt használatos oxitoein az agyalapi mirigy hátsó lebenyének hormonja. Az oxitoein élettani hatása a méh izomzatának összehúzása és a tejelválasztás serkentése, ennek megfelelően fő felhasználási területe a szülészet. Számos módszert dolgaztak ki a természetes oxitocin izolálására a kísérő vazopresszin, aminosavak, peptidek, egyéb hormonok és fehérjék mellől. Ezek a tisztítási és izolálási eljárások a következő típusokba sorolhatók: zónaelektroforézis különböző hordozókon, ioncserés kromatográfia, ellenáramú folyadékkromatográfia cs gélszűrés. Ezek az eljárások azonban — kivétel nélkül — analitikai jellegűek, cs legfeljebb csak néhány milligramm oxitoein kinyerésére alkalmasak. Az oxitoein tiszta állapotban való izolálása és szerkezetfelderítése után számos eljárást dolgoztak ki az oxitoein szintézisére. Mivel az oxitocint főként injekció formájában alkalmazzák, a szintézis végén kapott oxitocin-oldatból az oxitocint általában nem izolálják. Ebben az esetben a terméket biológiai aktivitásával jellemzik. A teljesen tiszta oxitoein biológiai aktivitása izolált tengerimalac- vagy patkányméhen, tyúk vérnyomását csökkentő hatásán vagy frissen szült nyúl tejelválasztását fokozó hatásán mérve kb. 500 NE/mg. Ennek alapján a gyártás utolsó lépésében bemért védett nonapeptidamid mennyiségéből kiszámítható, hogy a nem tisztított oxitocinoldatok milyen tisztaságúak. Esetenként a szennyezések mennyisége eléri a 30—80%-ot is; e szennyezések, ha nem is mérgezőek, de allergiás reakciót kiválthatnak, így az ilyen termék minősége nem felel meg a korszerű gyógyszerkészítményekkel szemben támasztott egyre szigorúbb követelményeknek. A természetes oxitoein izolálásakor az oxitocint aminosavaktól, peptidektől és fehérjéktől kell elválasztani, így jelentős tisztulást lehet elérni már egyszeri molekulasúly szerinti frakcionálással is. A szintetikus oxitocint viszont dimerek, oligomerek, sérült és töredékmolekulák szennyezik, amelyek a szintézis, a védöcsoport-eltávolítás vagy az oxidáció során képződnek. E szennyezők fizikai-kémiai és kémiai sajátságai jelentősen eltérnek a természetes hormont kísérő anyagokétól, így a szintetikus oxitoein tisztításakor a molekulasúly szerinti frakcionálástól alig várható jó eredmény. A szintetikus oxitoein tisztítására kidolgozott eljárásokat a következő fő csoportokba lehet osztani: 1. ellenáramú megoszlásos folyadékkromatográfia: Photaki, I., J. Am. Chem. Soc. 88, 2292 (1966); Guttmann, S., Hclv. Chim. Acta 49, 83 (1966); Bodanszky, M. és du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. SI, 2504 (1959), 2. megoszlási kromatográfia Sephadcx G-25 gyantán: Yamashiro, D., Nature 201, 76 (1964); Glass, J. D. és munkatársai, J. Am. Chem. Soc. 96, 6476 (1974), 3. gélszűrés Sephadex G-15 es G-25 gyantán: Manning, M. és munkatársai, J. Chromat. 38, 396 (1968); Fujino, M. és munkatársai, 2728462 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás és Clicm. Pharm. Bull. 26, 1576 (1978): Hughes, J. L. és munkatársai, 4212795 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás és 2647 843 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás; Mühlemann, M. és munkatársai, Helv. Chim, Acta 55, 2854 (1972), 4. az előzőekben említett módszerek kombinációjával: Meinhofer, J. A., 3960828 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Live, D. H. és munkatársai, J. Org. Chem. 42, 3556 (1977), valamint 5. adszorpciós kromatográfia szilikagélen: 6918030 számú holland szabadalmi leírás; Fleuret, G. és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés. 13, 137 (1979); Milkowski, J. D. és munkatársai, 4038 306 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás. Ezek az eljárások általában oldószer- és időigényesek. A tisztítandó anyagmennyiségre számított fajlagos oldószer- és/vagy géligényük nagy, ezért nem alkalmasak nagyításra, ipari méretű megvalósításra. A felsorolt módszerekkel csak néhány száz milligramm nyerstermék tisztítását írták le. Az egyetlen kivétel a Fleuret és munkatársai által kidolgozott adszorpciós oszlopkromatográfia szilikagélen, amellyel már 2,8 g oxitoein nyersterméket is tisztítottak, de ez az eljárás nem alkalmas ipari méretű tisztításra nagy oldószerigénye és költségessége miatt. Meglepő módon azt találtuk, hogy a nyers szintetikus oxitoein tisztítására eddig nem alkalmazott egyensúlyi'ioncserés kromatográfia előnyösen és jó eredménnyel alkalmazható az ilyen termék ipari méretű tisztítására, mivel gyorsan és egyszerűen kivitelezhető a gyógyszeriparban általánosan alkalmazott készülékekben, kromatográfiás oszlopokban, és lehetőség van a gyártás méretének növelésére. Az ioncserés tisztításhoz nincs szükség szerves oldószerre, így a munkavégzés során nincs balesetveszély és egészségi ártalom. Az egyensúlyi ioncserés kromaíográfiát erre alkalmas erős vagy gyenge kationcserélő gyantákon végezhetjük, előnyösen nagy elválasztóképességű és nagy terhelhetőségű kationcserélő gyantákat, különösen karboximetil-Sephadex C-25 gyantát alkalmazhatunk erre a célra. Karboximetil-Sephadex C-25 gyanta használata esetén különös előnyt jelent a gyanta kivételesen nagy elválasztóképessége és terhelhetősége, valamint az egyensúlyi ioncserés kromatográfiára való előnyös alkalmazhatósága. A nagy terhelhetőség azt jelenti, hogy a tisztításnak — szemben az eddig alkalmazott eljárásokkal — kicsi a fajlagos gyantasziikséglctc a gyanta kitűnő elválasztóképessege miatt. Az egyensúlyi ioncserés kromatográfia alkalmazása azzal az előnnyel jár, hogy az elució során a gyantaágy térfogata állandó. Mivel a gyanta regenerálására az elucióra alkalmazott oldatot lehet használni, az egyes tisztítások után a gyantát nem kell eltávolítani az oszlopból, és a regenerálást követően azonnal megvalósítható egy újabb tisztítás. Az egyensúlyi ioncserélő kromatográfiát 5 és 6 közötti, előnyösen 5,4 körüli pH-értékű ammónium-acetát-pufferoldat alkalmazásával végezzük, aminek további előnye, hogy az ammónium-acetát a kívánt mértékig eltávolítható a tiszta oxitoein mellől a liofilizáláskor. A találmány tehát oly eljárás szintetikusan előállított oxitoein tisztítására, amelynek során a nyers oxitocin-oldatot kationcserélő gyantából — előnyösen gyengén savanyú, karboximetil-csoporttal módosí5 IC 1 6 20 25 30 35-10 45 50 r. c; 60 35 2
