183652. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biciklusos vegyületek előállítására
1 183 652 2 1. kísérlet A találmány szerinti vegyületek angiotenzin I. átalakító enzim (ACE) gátló hatásának vizsgálata A kísérletet Cushman et al. (Biochemical Pharmacology, Vol. 20, 1637/1971) által leírt módszer módosított változatával végeztük. Azaz szubsztrát gyanánt hippuril-L-hisztidil-L-leucint (HHL) használtunk és az ACE-re gyakorolt gátló hatást azzal fejeztük ki, hogy meghatároztuk, hogy az ACE által termelt hippur-sav mennyiségét hány százalékban csökkenti a találmány szerinti vegyület hozzáadása. A találmány szerinti vegyületet 0,02—2%-os dimetil-szulfoxidban oldottuk és ehhez 100 mM kálium-foszfát puffer oldatot adunk hozzá, (pH = 8,3, és 300 mM nátrium-klorid-tartalom) 100 pl ACE-nez (protein koncentráció 20 mg/ml) és 100 pl 1,25 mM-os HHL-hez. Ebben a kísérletben kontrollként olyan kálium-foszfát puffer oldatot használtunk, amely a dimetil-szulfoxidot ugyanolyan koncentrációban tartalmazta, mint a vizsgálandó oldat. Miután az oldatot 37 °C-on 1 óráig inkubáltuk, 150 pl In sósavoldatot adunk hozzá, hogy a reakciót leállítsuk. 1 ml etil-acetát hozzáadása után az oldatot 3000 ford/percen 10 percig centrifugáltuk. 0,5 ml alikvot részt különítettük el az etil-acetátos rétegből és ezt 50 °C alatti hőmérsékleten nitrogén áramban megszáritottuk. A maradékot 5 ml 1 mól-os vizes nátrium-kloriddal elkevertük és az elegyet kolorimetráltuk 228 nm hullámhossznál. Az 1., 7., 8., 9. és 19. példákban leírt vegyületekre kapott vizsgálati eredményeket a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat A vizsgálati vegyület Koncentráció pM példaszáma Gátló hatás az ACE-re % 1 1 87 10 97 7 1 91 10 97 8 1 69 10 99 9 1 72 10 95 19 1 95 10 98 2. kísérlet A találmány szerinti vegyületek hatásának vizsgálata az angiotenzin I. vérnyomásnövelő hatásával szemben Kísérleti állatként olyan 250—350 g súlyú hím patkányokat (Sprague-Dawley) használtunk, amelyek táplálékhoz és ivóvízhez szabadon hozzájutottak. A patkányokat intraperitoneálisan adagolt 50 mg/kg nátriumpentobarbitállal elaltattuk a vizsgálatot megelőző napon, és a vérnyomás megmérése céljából mindegyik femorális artériájába egy polietilén csövet helyeztünk, a femorális vénába pedig az angiotenzin I. és II. beinjektálása céljából helyeztünk polietilén csövet, majd a csöveket rögzítettük. A vizsgálat napján a kontroll fázisban az átlagos vérnyomást feljegyeztük egy elektromos hemodinamométer segítségével (MP-4T modell, Nippon Kodén gyártmány, Japán) és ezután angiotenzin I-et és angiotenzin Il-t injektáltunk a femorális vénán át 300 ng/kg, illetve 100 ng/kg dózisban a vérnyomásfokozó hatás mérése céljából. Ezután a találmány szerinti vegyületből 13,8 pM/kg-ot adagoltunk orálisan vizes oldat, vagy vizes gumiarabikum szuszpenzió formájában és ennek beadása után 20, 60 és 120 perc múlva angiotenzin I-et és Il-t injektáltunk újra a vérnyomásnövelő reakció nyomon követése érdekében. Az angiotenzin I vérnyomásnövelő hatására vonatkozó %os gátlás kiszámításánál a %-os gátló értéket korrigáltuk az angiotenzin II által kiváltott vérnyomásnövelő reakció időbeli változása alapján. Vizsgálati eredmények Az 1., 7., 9. és 15. példák vegyületeivel kapott vizsgálati eredményeket az alábbi, 3. táblázat mutatja. 3. táblázat A vizsgálandó Az angiotenzin I által kiváltott vérnyomásvegyület növelő reakcióval szembeni %-os gátló hatás példaszáma 20 perc 60 perc 120 perc múlva múlva múlva 1 93 88 77 7 84 91 96 9 88 71 51 15 84 80 65 Előállítási példa A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületeket többek között a magas vérnyomás kezelésére lehet használni a következő összeállításban: 1. Tabletták 1. N-(l-etoxikarbonil-3-fenilpropil)-L-alanil-N-(indán-2-il)-glicin-hidroklorid 10 g 2. Laktóz 90 g 3. Kukoricakeményítő 29 g 4. Magnézium-sztearát 1 g 130 g 1000 db tablettához A fenti 1. és 2. összetevőket, valamint 17 g kukoricakeményítőt összekeverünk és granulálunk 7 g kukoricakeményítőből készült paszta felhasználásával. A kapott granulumokhoz 5 g kukoricakeményítőt, vala-5 10 1E 2( 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
