183435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarhák vemhességének korai megállapítására
1 183 435 2 antigén felhasználásával RIA-val — meghatározzuk, azon alapul, hogy a RIA-hoz szükséges specifikus antiszérumot progeszteron-6-karboximetil-tioéter-marhaszérum-albumin antigénnel állítjuk elő. Az eljárás további ismérve lehet, hogy a RIA-hoz alkalmazandó tejmintákat a négy tőgynegyedből származó, délutáni fejésű, azonos arányban összekevert elegyelőtejből állítjuk elő. A találmány szerinti eljárás során a progeszteron koncentrációja a szarvasmarhák tejéből és/vagy vérszérumából közvetlenül meghatározható. A vizsgálatok a szarvasmarhák inszeminálását követő 21.± 3. napon vett mintákkal végezhetők. A RIA pontossága megfelel a nemzetközi követelményeknek. Az eljárással a szarvasmarhák nem vemhes állapota 97%-os biztonsággal diagnosztizálható. A találmány szerinti eljárás gazdaságosságát a nem vemhesült és nem ivarzó állatok korai kiszűréséből és ezáltal az „üres” időszak lerövidítéséből származó lényeges előny mellett két további tényező is alátámasztja. A négy tőgynegyedből származó, azonos mennyiségben vett elegy-előtej felhasználása a módszert a nagyüzemi állattartás feltételei között is alkalmazhatóvá teszi, mivel a mintavétel a gépi fejest kötelezően megelőző egészségügyi tőgyvizsgálattal egyidejűleg elvégezhető. Megemlítendő továbbá, hogy a RIA-hoz használatos, a kereskedelemben kapható antigének és antiszérumok legnagyobb részt tőkés importból szerezhetők be, míg a találmány szerinti eljárás során felhasznált antigént és antiszérumot az eljárás során állítjuk elő. A találmányt példák kapcsán ismertetjük közelebbről: 1. példa Szarvasmarhák vemhességének megállapítását végeztük progeszteron RIA alkalmazásával. A vizsgálathoz szükséges antiszérum készítése során először a progeszteronból a Sendheimer és Kaufman (J. Amer. Chem. Soc. 75/19753/4712) által ismertetett eljárással 6-Brprogeszteront, majd ebből Lindner és mtsai (Steroids 19/1972/357.) módszerével progeszteron-6-karboximetil-tioétert (haptént) állítottunk elő. A haptént vegyes anhidrides technikával, Erlanger és mtsai (J. Bioi. Chem. 228/1957/713) módszerével marhaszérum-albuminhoz kapcsoltuk. Az így előállított antigénben az egy hordozó molekulához kapcsolt haptének száma 25 volt. Az elkészített antigénnel és komplett Freund-adjuvánssal 5 hónapon át immunizáltunk újzélandi nyul'akat és kecskéket. Az újzélandi hím nyulakból előállított antiszérum titere 1:30000, affinitási konstansa k = 1,49* •1010 dm3/mól volt, az antitestek koncentrációja az antiszérumban 1,34* 10_ 10 mól/dm3 volt. Az antiszérum specifitását 14 szteroiddal ellenőriztük, és ezek közül csak a pregnenolon (39,3%) a 6j3-hidroxi-progeszteron (14,2%) és a dezoxikortikoszteron (2,1%) adott számottevő keresztreakciót. A RIA-hoz szükséges mintákat a szarvasmarhák inszeminálását követő 21. ± 3. napon, a négy tőgy negyedből származó délutáni fejésű, azonos mennyiségben öszszekevert elegy-előtejből vettük. A RIA kiértékeléséhez alacsony progeszteron-tartalmú minták is szükségesek. Ezeket ovariektomizált teheneknek az előbbiekben ismertetettel azonos körülmények között gyűjtött elegy -előtejből állítottuk elő. A RIA kivitelezése a továbbiakban az eljárás közismert általános metodikája szerint történt. Az eredmények pontosságát vizsgálva azt találtuk, hogy egy sorozaton belül (intraassay) az eredmények szórása 10,2%-és 15,3% között, az egyes méréssorozatok között pedig (inter-assay) 14,1 és 23,8% között változott. Ezek az értélek megfelelnek a nemzetközi követelményeknek. A progeszteron-koncentráció értéke alapján az állatokat három csoportra osztottuk fel (lásd a mellékelt táblázatot): a) Nem vemhesnek azokat a teheneket tekintettük, amelyeknél az elegy-előtejben mért progeszteronkoncentráció 9,6 mól/dm3 (3,0 ng/ cm3) alatt volt. b) A „kétes” csoportba soroltuk azokat a teheneket, amelyeknél a tejminták progeszteron-tartalma 9,6 és 28,8 mól/dm3 (3,0—9,0 ng/cm3) között volt. c) Vemhesnek tekintettük azokat az állatokat, amelyeknél a tejminták progeszteron-tartalma 28,8 nmól/dm3 (9,0 ng/cm3) fölött volt. A vizsgált 890 szarvasmarha közül az elvégzett vizsgálat alapján 233-at tekintettünk nem vemhesnek (26,2%), ezt 97,8%-os biztonsággal állapítottuk meg. A „kétes” csoportba 207 szarvasmarhát (23,2%) soroltunk, ezek közül az inszeminálást követő 42. napon végzett rektális vizsgálat alapján 45 állat (21,7%) bizonyult vemhesnek. A vemhes csoportba sorolt 450 tehén (50,6%) közül az inszeminálást követő 42. napon végzett rektális vizsgálat alapján 248 állat bizonyult vemhesnek (55,1%), E 202 „üres” állat számos esetében magzatvizelést, illetve magzatvesztést állapítottunk meg. 2. példa Szarvasmarhák vemhességének megállapítását végeztük progeszteron RIA alkalmazásával. A vizsgálathoz szükséges antiszérumot az 1. példában ismertetett módon készítettünk. A RIA-hoz szükséges mintákat a szarvasmarhák mesterséges inszeminálását követő 21. ± 3. napon, vénából reggel vett vérből állítottuk elő. A vért + 4°C-on centrifugáltuk, és a leszívott vérszérumot felhasználásig — 15°C-on kifagyasztva tároltuk. A RIA-hoz szükséges alacsony progeszteron-tartalmú vérszérummintákat ovariektomizált tehenekből, az előbbiekben ismertetett körülmények között vettük. A RIA kivitelezése a továbbiakban az eljárás közismer' általános metodikája szerint történt. A nem vemhes tehenek vérszérumában mért progeszteron-koncentráció 7,36 nmól/dm3 (2,3 ng/cm3) alatt volt, ezen érték felett a teheneket vemhesnek tekintettük. 3. példa Szarvasmarhák vemhességének megállapítását végeztük progeszteron-RIA alkalmazásával. A vizsgálathoz szükséges antiszérumot az 1. példában ismertetett eljárással készítettük el. A vizsgálatokhoz a szarvasmarhák inszeminálását követő 21. ± 3. napon, délutáni fejésű, a négy tőgynegyedből származó, azonos mennyiségben összekevert elegyelőtejből és reggel, vénából vett vérből elválasztott vérszérumból vettünk mintákat. A RIA kivitelezése a továbbiakban az eljárás közismer', általános metodikája szerint történt. Az elegyelőtcjbói és vérszérumból végzett párhuzamos vizsgálatokból megállapítottuk, hogy összefüggés van a két mintatípusban mért progeszteron-koncentráció között, és az elegyelőtejben lényegesen nagyobb (1,3—7-szeres) a progeszteron mennyisége, mint a vérszérumban. Ezek szerint az elegyelőtej vizsgálatával érzékenyebben, és technikailag könnyebben kivitelezhető módon követhete a szarvasmarhák belső elválasztású mirigyeinek progeszteron-termelése. A találmány szerinti eljárás több szempontból előnyös. A nem vemhesült állatok inszeminálást követő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
