183433. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűszűvirág (Digitális Lanata EHRH.) szaporítóanyag előállítására szövettenyészetben
1 183 433 2 szaharóz 3000,0 mg/1 agar-agar 1000,0 mg/1 *— A Fe(ll) EDTA komplex oldatot az 1. példában leírtak szerint készítjük. A táptalaj pH értékét autoklávozás előtt 1 n NaOH- dal 5,6-ra állítjuk be. A táptalajból 80-80 ml-t 0,5 1-es befőttes üvegekbe adagolunk és 121°C-on 20 percig autoklávban sterilezzük. A növényeket 3-4 hétig klímaszobában tartjuk a 8— 10 cm-es magasság eléréséig (3-4 hét: 26±rC, 70% relatív páratartalom; 10—12000 lux megvilágítás; fényforrásként AÎRAM FLORALUX L65/80 típusú vörösben és kékben gazdag és TUNGSRAM 65W F33 WHITE fehérben gazdag fénycsövek kombinációját alkalmaztuk 8 órás éjszaka (16 órás nappal fotoperiódus mellett). A kifejlett palánták 2—3 lombleveles hajtásait 1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm indolecetsav tartalmú fenti táptalajra oltjuk és klimaszobában neveljük. 5-6 hét után a képződött levélrózsákat leválasztjuk. A hajtásokat gyökeresítés céljából 0,5 ppm indolvajsavat tartalmazó fenti táptalajra oltjuk. 2 hét eltelte után a 4—8 mm hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket növekedésszabályozók nélküli táptalajra oltjuk és a teljes meggyökeresedésig tovább neveljük (2-3 hét). Egyetlen magból kiindulva átlagban 20—40 egyedi életre képes növényt nyerünk. A 4-6 cm-es hosszúságú gyökérrel rendelkező növényeket tőzeg:perlit 1:1 arányú elegyébe ültetjük, hidegen nyújtható, átlátszó fóliával (LTE 5228 Borsodi Vegyi Kombinát) egy hétre lefedjük, majd a fólia eltávolítása után kb. 4 hétig üvegházban, kontrollált körülmények között neveljük. (70% relatív páratartalom, természetes megvilágítás, 24/16 °C hőmérsékletváltás.) A fenti módon előállított és megerősödött növények a szabadföldi kiültetés során 95%-os megeredést mutatnak. A mikroszaporított vonalak homogenitását a növénymagasság és 1000 magsúly átlagértékekkel az átlag szórásával (Sx_) és a variációs koefficiens értékekkel (cv%) jellemezzük. (2. táblázat) 2. táblázat Vonal Egyedszám db Növénymagasság cm átlag±szórás Variácós koefficiens cv% 1. 7 76,1+4,6 5,9 2. 8 82.2±5,5 6,6 3. 7 82,4±3,0 3,6 4. 7 76.8±4,0 5,2 kontroll 7 73,4±7,2 10,1 Vonal Egyedszám 1000 magsúly Variációs db mg koefficiens átlag±szórás cv% 1. 7 51±0,9 5,0 2. 8 41 ±0,9 6,1 j. 7 45±1,2 7,2 4. 7 50±1,1 6,0 kontroll 7 47±2,7 15,4 Az alacsony szórás és variációs koefficiens értéke a kontroll mellett teljes homogenitást jeleznek. 3. példa Nemesített, hatóanyagtartalomra levizsgált szabadföldi gyűszűvirág 6-8 cm-es hajtáscsúcsát kivágjuk és Na-hipoklorit 3%-os vizes oldatával 20 percig fertőtlenítjük. A 3-5 mm-es hajtásmerisztémát steril körülmények között kipreparáljuk és az első példában leírt Nitsch-féle táptalajra helyezzük. A 2-3 lombleveles hajtásokat az 1. példában ismertetett szaporító táptalajra helyezzük és az ott megadott körülmények között neveljük, majd 1 hónap után a képződött levélrózsákat leválasztjuk és a továbbiakban is az 1. példa szerint járunk el. Beltartalmi vizsgálatok igazolják, hogy az összglikozid tartalom, illetve a C-sorbeli glikozidok mennyisége a mikroszaporítás során nem változott, leromlást nem tapasztaltunk. 4. példa Szántóföldön nevelt gyűszűvirág kifejlett növényekből steril hajtásmerisztémát preparálunk a következőképpen: a hajtásról a 60 mm-nél hosszabb leveleket eltávolítjuk és bőséges folyóvízben történő mosás után 70%-os alkoholban 5 percig áztatjuk. Steril vizes mosás után 5%os Na-hipokloritban 10 percig áztatjuk, majd a felső levelek eltávolítása után a hajtáscsúcsot a 2. példában leírt Linsmaier-Skoog-féle táptalajra helyezzük. A 2-3 lombleveles hajtást 0,01 ppm 2,4-dikIórfenoxiecetsavat + 0,1 ppm benzilaminopurint tartalmazó, fent említett táptalajra oltjuk. 5-6 hét után a képződött levélrózsákat leválasztjuk. A leválasztott levélrózsákat 2. példában megadott táptalaj olyan módosított változatára oltjuk, melyben a következő komponensek mennyiségét a felére csökkentettük. A módosított komponensek mennyisége a következő: NH4NO3 825,0 mg/1 KNO3 950,0 mg/1 CaCV2H20 220,0 mg/1 MgSOWHjO 185,0 mg/1 KHjP04 85,0 mg/1 Adalékként a táptalajt 0,1 ppm indolvajsawal egészítjük ki. A leválasztott levélrózsákat hét hétig 2. példában megadott körülmények között tartjuk, majd a gyökerek megjelenése után a fenti, módosított, de indolvajsavat nem tartalmazó táptalajon 5-6 cm hosszúságú gyökerek megjelenéséig tovább neveljük a teljes kifejlődésig. A növényeket a 2. példában leírt módon a szántóföldi körülményekhez szoktatjuk. A mikroszaporított palántáról nevelt növények összglikozid tartalma és a C-sorbeli glikozidok mennyisége az anyanövényekhez képest szignifikáns különbséget nem mutat. 5. példa Az 1. és 3. példában leírt eljárást úgy módosítjuk, hogy az oldalhajtásképződést indukáló táptalajon (1 ppm indolecetsav + 1 ppm benzilaminopurin + 0,1 ppm gibberellinsav) képződött levélrózsákat nem gyökeresitjük meg, hanem ismételten szaporítótáptalajra helyezzük, amelyen négy hetes inkubáció után újabb levélrózsa képződést tapasztalunk. Az eljárást háromszor ismételjük, majd a növényeket az 1. példában leírt módon meggyökereztetjük. Tíz csíranövényből kiindulva ezen a módon összesen 3000 gyökeres palántát nyerünk. A palánták előkészítése a szántóföldi kiültetéshez megegyezik az 1. példában leírt módszerrel. 6. példa A 2. és 4. példában leírt eljárást úgy módosítjuk, hogy a növekedésszabályozókat tartalmazó Unsmaier-Skoog-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
