183432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek specifikus leoldására szilikát tipusú adszorbensről
1 183 432 2 sen tisztább. Azonos tisztaságú tüdőkivonatból kiindulva, a 153 247 számú magyar szabadalmi leírás szerinti eljárással átlagban 2,3 TIE/g, illetőleg 0,45—0,8 millió KIE/g fehérje tisztaságú termék volt nyerhető, a jelen találmány szerint eljárva 1,1—2,1 millió KIE/g, illetőleg 4,2—8,0 TIE/g fehérje tisztaságú termék nyerhető (TIE: tripszin-inhibitor egység; KIÉ: kallikrein-inhibitor egység). A találmány szerinti eljárás további előnye, hogy olyan anyagok is alkalmazhatók a leoldásnál, amelyek a polípeptidek kinyerésére alkalmazott acetonos kicsapás esetében a polipeptid-csapadék elkülönülése után lehetővé teszik a kicsapáshoz használt aceton regenerálását. A korábbi eljárásban leoldószerként alkalmazott etanol (fp: 78,3° C) és a kicsapáshoz használt aceton (fp: 56,3°C) forráspontjai között az eltérés 22°C, ez az oldószerek regenerálhatóságát olyan mértékben megnehezíti, hogy az már nem oldható meg gazdaságosan. Ezzel szemben a magasabb forrpontú Lewis-bázisoknak a leoldáshoz való alkalmazásával elkerülhető az acetonhoz közelálló forráspontú rövidszénláncú alkoholok alkalmazása, így a kicsapáshoz használt aceton és a leoldáshoz használt Lewis-bázis desztillálással egymástól könnyen elválasztható. Az alkalmazható Lewis-bázisok közül például a dimetilformamid forráspontja 153 °C, a dioxáné 106 °C, az acetamidé 221 °C. Az oldószerek ezáltal lehetővé váló regenerálhatósága igen jelentős gazdasági előnyt jelent. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik. A példák szerint előállított termékek hatékonyságának és tisztaságának a meghatározására az alábbi módszereket alkalmaztuk: A kallikrein-inhibitor aktivitást (KIÉ) Werle-Kaufmann-Boetsch szerint [Hoppe-Seyler’s Z.f.physiol. Chem. 319, 52 (I960)], a tripszin-inhíbitor aktivitást (TIE) pedig Anson szerint [J. Gen. Physiol. 22, 79 (1949)] mértük. A fehérjetartalmat a 280 gm hullámhosszon mért extinkció alapján számítottuk. 1. példa 100 kg marhatüdö 400 liter térfogatú vizes kivonatát, amely összesen 150 millió KIÉ és 577 TIE aktivitású polipeptidet tartalmaz, kalcium-hidroxiddal 5,6 pH-értékre állítjuk be, majd 4 kg savval aktivált bentonitot adunk az oldathoz és egy óra hosszat keverjük. Ezután az adszorbenst szűréssel elkülönítjük és vízzel átmossuk, majd 60 tf% etanolt, 10 tf% dimetil-formamidot és 0,2 n végkoncentrációnak megfelelő mennyiségű sósavat tartalmazó vizes elegy (pH = 0,8) 10 literével fél óra hosszat keverjük, leszűrjük és ezt a műveletet 5 liter ugyanilyen vizes eleggyel megismételjük. A szűrleteket egyesítjük és háromszoros térfogatú acetonnal kicsapjuk a polipeptidhatóanyagot, a csapadékot szűréssel elkülönítjük és levegőn megszárítjuk. Az acetonnal kicsapott termék, 138 millió KIÉ és 530 TIE össz-aktivitást tartalmaz, 1,1 millió KIE/g, illetőleg 4,23 TIE/g fehérje tisztaságban, ami 92% hozamnak felel meg. Ebből a száraz csapadékból az inhibitor-hatású polipeptid ismert módszerekkel nyerhető ki. például oly módon, hogy a száraz csapadéksúly tízszeresének megfelelő mennyiségű 90%-os etanollal keverjük, leszűrjük és a műveletet a csapadéksúly ötszörösének megfelelő mennyiségű 90%-os etanollal megismételjük, majd az egyesített szüredékhez két és félszeres térfogatú acetont adva újból kicsapjuk a polipeptidhatóanyagot. 2. példa 100 kg marhatüdőből származó vizes kivonatból az 1. példában leírttal egyező módon 4 kg savval aktivált bentonitra adszorbeáltatjuk a nyers hatóanyagot. A leoldást 10 liter, majd 5 liter 70% metanolt és 10% acetamidot tartalmazó 0,1 n vizes sósavoldattal (pH = 1,45) végezzük, a két leoldó-folyadékot egyesítjük és a polipeptid-hatóanyagot háromszoros térfogatú aceton hozzáadásával csapjuk ki az oldatból. A kapott csapadékot leszűrjük, és megszárítjuk, oldjuk. Az így kapott tennék 138 millió KIÉ és 530 TIE aktivitást tartalmaz, ami a kiindulási kivonat hatóanyag-tartalma 92%-ának felel meg. A termék tisztasága 1,6 millió KIE/g illetőleg 6,1 TIE/g fehérje. 3. példa 10 kg marhatüdőből kapott 40 liter vizes kivonatból, amely 20,5 millió KIÉ és 78,8 TIE aktivitású polipeptidet tartalmaz, 600 g őrölt montmorilloniton adszorbeáltatjuk a hatóanyag-polipeptidet. Az adszorbenst vízzel átmossuk, majd 90% dimetil-formamid és 10% 0,5 n vizes sósavoldat tízszeres térfogatú elegyével (pH = 2,1) eluáljuk. Az eluátumból két és félszeres térfogatú aceton hozzáadásával kicsapjuk a hatóanyagot, a csapadékot elkülönítjük, megszárítjuk, majd az 1. példában leírt módon, 90%-os alkoholban történő oldás és acetonnal való újbóli kicsapás útján tisztítjuk. Az így kapott termék 17,4 millió KIÉ és 67 TIE aktivitású és 2,4 millió KIE/g fehérje, illetőleg 9,2 TIE/g fehérje tisztaságú. A nyers tüdőkivonat aktivitására számított hozam: 85%. 4. példa 1 kg marha-parotiszból kapott 5 liter vizes kivonatot, amely 1,9 millió KIÉ és 7,26 TIE aktivitást tartalmaz, kalcium-hidroxiddal 5,6 pH-értékre állítunk be, majd ebből a vizes kivonatból az aktív anyagot savval kezelt bentonitra adszorbeáltatjuk. Az adszorbensen megkötött hatóanyagot 40 tf% etanol, 30 tf% dimetil-szulfoxid és 30 tf% víz sósavval 2,5 pH-értékre savanyított elegyével eluáljuk. Az eluátumból az előző példák szerint acetonnal kicsapott termék 1,68 millió KIÉ és 6,42 TIE aktivá-, tású, a hatóanyag-polipeptid 1,85 millió KIE/g fehérje, illetőleg 7,1 TIE/g fehérje tisztaságú. A nyers parotisz-kivonat aktivitására számított hozam: 88 %. 5. példa 10 kg marha-pankreászból kapott vizes kivonatból, amely 8,5 millió KIÉ és 32,7 TIE aktivitást tartalmaz, 400 g őrölt, savval kezelt bentonitra adszorbeáltatjuk a polipeptidet. A leoldást 4 liter olyan oldószereleggyel végezzük, amely 60% dioxánt és 40% vizes sósavat tartalmaz, az elegy pH-ját 2,5-re állítjuk be és a pH-értéket az egy órán át tartó keverés közben több alkalommal 2,5-re korrigáljuk 2 n sósavoldat adagolásával. Az eluátumból a hatóanyagot háromszoros térfogatú acetonnal kicsapjuk, a csapadékot elkülönítjük, és megszárítjuk. A termék 6,8 millió KIÉ és 26,1 TIE összaktivitást tartalmaz, 2,1 millió KIE/g és 8,2 TIE/g fehérje tisztaságban; a nyers pankreász-kivonat aktivitására számított hozam: 80%. 6. példa 10 kg marhatüdőből kapott 50 liter vizes kivonatból, amely 17 millió KIÉ és 65 TIE aktivitású polipeptidet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
