183324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új apovinkaminol 3',4',5'-trimetoxi-benzoát és savaddíciós sói előállítására
1 183 324 2 A találmány tárgya eljárás új apovinkaminol-3’,4’,5’trimetoxí-benzoát és savaddíciós sói előállítására. Az új vegyületet oly módon állíthatjuk elő, hogy az apovinkaminolt, vagy savaddíciós sóját 3,4,5-trimetoxibenzoesawal vagy annak acilezésre képes származékával reagáltatjuk, és a kapott terméket kívánt esetben savaddíciós sóvá alakítjuk. Az apovinkaminol és acetátja, valamint szívkoszorúérre gyakorolt hatásuk már ismert (2.035.784 sz. francia szab. leírás). Ismert továbbá az apovinkaminol-benzoát általános értágító hatása [166.476 sz. magyar szabadalmi leírás; CA 82, 129.279 v (1975)], valamint az apovinkaminol 3—12 szénatomos alkánkarbonsavakkal alkotott észterei agyi értágító hatása (171.662 sz. magyar szabadalmi leírás = US 4.108.996 = DE-PS 26.32.118). Az eddig ismert apovinkaminol-észterek tehát mind értágító hatásúak. Ezzel szemben a találmány szerinti új vegyület a foszfodiészteráz enzimaktivitását gátolja, és elsősorban kóros sejt-proliferációval járó bőrbetegségek gyógyítására, illetve e betegségek kiújulásának megelőzésére használható, Az epidermis kóros proliferációjával járó megbetegedések viszonylag gyakoriak és a lakosság néhány százalékát érintik. Ezek között a betegségek között jó- és rosszindulatúak egyaránt előfordulnak, így például psoriasis atopias dermatitis, primer kontakt dermatitis, allergiás kontakt dermatitis, baso- és spinocellularis carcinoma, ichthyosis, premalignus hyperkeratosis, fény indukálta keratosis, acne és seborrhoeas dermatitis. Bizonyos kór-formák csak emberen, mások emberen és állaton egyaránt előfordulhatnak. Minthogy a kóros sejt-proliferációval járó bőrbetegségek egy része, így például a psoriasis állatokon nem fordul elő, a vegyületek psoriasis elleni hatását állatkísérletekkel csak indirekt módon lehet valószínűsíteni. Voorhees és munkatársa [Arch. Derm. 104 359—365. (1971)] megállapította, hogy a kóros sejt-proliferációt a ciklusos-adenozin-monofoszfát (c—AMP) szintjének csökkenése kíséri. Mint ismeretes a c—AMP adenilcikláz hatására keletkezik és foszfodiészteráz hatására bomlik el. Voorhees eredményesen befolyásolta a psoriasisos folyamatot olyan szerekkel, melyek az adenilcikláz működését stimulálják, (például norepinephrin), vagy amelyek a foszfodiészteráz működését gátolják (például papaverin). Modell-kísérleteink megtervezésénél abból a feltevésből indultunk ki, hogy Voorhees megállapítása fordítva is igaz: ha egy vegyület esetében bizonyítható, hogy gátolja a foszfodiészteráz működését, akkor ez a körülmény indirekt módon valószínűsíti, hogy a vegyület psoriasis vagy más kóros sejt-proliferációval járó bőrbetegségek gyógyítására alkalmas. A feltevés utólag igazolódott: amely vegyületeknél in-vitro foszfodiészteráz-gátló hatást találtunk, azok a klinikai kísérletben is beváltak psoriasis kezelésére. A modell-kísérleteket állati testszövetekből (patkányagy, marhaagy, marhaszív) izolált foszfodiészteráz segítségével végezzük. Az enzim-izolálás J. Schröder és H. V. Richenberg módszerével [Biochem. Biophys. Acta 302, 50 (1973)] történt, majd az izolált foszfodieszterázt J. G. Hardman és E. W. Sutherland módszerével tisztítottuk [J. Biol. Chem. 240, 3704 (1965)] s végül a tisztított enzim aktivitását G. Pöch rádióizotópos módszerével triciált c AMP fölöslege (0,1 mmól c— AMP szubsztrát, melyből a 3H-C-AMP 2,59 kBq) jelenlétében inkubációs rendszerben először a gátlószer nélkül, majd apovinkaminol-3’,4’,5-trimetoxi-benzoát, mint gátlószer jelenlétében 20 perc inkubálási idő után megmértük [N. S. Arch. Pharmacol. 268, 272 (1971)]. A vizsgált vegyületből 1 mmólos sósavas-vizes törzsoldatot készítettünk, s a törzsoldat segítségével az inkubált enzim-preparátumhoz különböző mennyiségeket adtunk úgy, hogy az inkubált mintában a vegyület koncentrációja 5X1CT7, IX10"6, 5X10T6, 1XKT , 5X1CT5 és 1CT4 mól/liternek feleljen meg. Analóg módon adtuk az enzimpreparátumhoz a referencianyag (papaverin) vizes oldatát is. A kontroll (gátlószer nélküli enzim-oldat) aktivitását 100%-nak vettük, és az apovinkaminol-3’,4’,5’-trimetoxi-benzoátot, valamint papaverint tartalmazó oldatok aktivitását a kontroll százalékában fejeztük ki. A patkányagyból preparált enzimen mért eredmények a következők: Vizsgált vegyület (enzim-inhibitor) A vizsgált vegyület lxlCU 5XKT6 lxl(T5 5X1CT5 lxl(T4 mól/liter koncentrációjú oldata hatása az enzim-aktivitásra a kontroll %-ában Apovinkaminol-3’,4’,5 ’-trimetoxi-benzoát.HCl 94,0 64,5 49,2 47,2 44,8 Papaverin.HC1 91,2 89,7 60,5 38,8 Analóg módon mértük a marhaagy, marhaszív preparátumból nyert enzimen is az eredményeket. Az eredmények felhasználásával grafikonon ábrázoltuk az enzimaktivitást a /U mólban kifejezett enzim-inhibitor koncentráció logaritmusa függvényében, és a görbéről leolvastuk azt az enzim-inhibitor koncentrációt, mely 50%-kal csökkenti az enzim-aktivitást (I50). A kapott eredményeket az alábbi táblázat mutatja: Vizsgált vegyület M mólban kifejezett Is() értékek marha- marha- patkányagyból szívből agyból kipreparált foszfodiészteráz enzimen Apovinkaminol-3’,4’,5’-trimetoxi-benzoát.HCl 5 1,5 10 Papaverin.HC1 90 50 70 A táblázatból látható, hogy új vegyületünk marhaagyból izolált enzimen 18-szor, marhaszívből izolált enzimen 33-szor és patkányagyból izolált enzimen 7-szer hatásosabbnak bizonyult, mint a referencia-anyagként alkalmazott papaverin. Az első klinikai vizsgálatokat a hatóanyagot tartalmazó, külsőleges kezelésre alkalmas készítményekkel (kenőcs, krém, oldat, tinktúra, paszta, aeroszol) végeztük. Nevezetesen 2%, 1%, 0,5%, 0,25% és 0,1% apovinkaminol-3’,4'',5’-trimetoxi-benzoátot tartalmazó krémeket alkalmaztunk. A beteg-anyagot psoriasisban szenvedő betegekből válogattuk össze, s ezen belül a kiválasztás további alapvető szempontja az volt, hogy a vizsgált betegek egyidejűleg az alap-betegségüket érintő szisztémás kezelésben, például immunszupresszív, citosztatikus vagy glukokortikoid kezelésben nem részesültek. A választott betegeket 5-ös csoportokban az ún. plaque-módszerrel vizsgáltuk. Szimmetrikusan elhelyez5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
