183302. lajstromszámú szabadalom • Eljárás helyettesített benzolnitril-származékok előállítására
1 183 302 2 kívánt vegyületet tartalmazta alkalmas koncentrációban, vagy egyáltalán nem tartalmazott vegyületet. Az ebben a kísérletben alkalmazható táptalajok részletesebb leírása biokémiai alapkönyvekben, például a következő könyvben szerepel: Kuchler, Biochemical Methods in Cell Cul- 5 tűre and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., Stroudsberg, Pa. (1977). Ezután a táptalajba 0,05 ml 1A típusú thinovirust (RV— 1A), 2 típusú rhinovirust (RV—2) vagy Coxsackie A2 , vírust (Cox A2 1) adtunk. Egyes vegyületeket 5 típusú rhinovírussal (RV—5), 8 10 típusú rhinovírussal (RV—8) vagy 64 típusú rhinovírussal (RV—64) szemben is vizsgáltunk. A kontrollként használt sejtekhez nem adtunk vírust. A tenyészeteket a vegyületek citotoxicitása és a vírus citopatikus hatás (CPE) szempontjából vizsgáltuk, a kezelés után 48 és 72 órával. 15 Bizonyos vegyületek állati szervezetekben kifejtett hatását is megvizsgáltuk, a következő eljárást alkalmazva („egyetlen orális dózis”-próba). 10—12 g súlyú, hím Swiss egereknek interperitoneálisan (IP) normális körülmények között letális dózisú Cox A21 vírus foszfáttal 20 puffereit vizes konyhasóoldatát adtuk 0,2 ml mennyiségben. Az oldat 1% hőhatással inaktivált borjúembrió szérumot is tartalmazott. A letális dózis megjelölést itt olyan dózisra használjuk, amely a beadástól számított 10 napon belül 80—100%-os mortalitást eredményez a meg- 25 fertőzött állatoknál. 3 órával később az egereket orálisan 0,2 ml, 0,5%-os hidroxi-propil-metil-cellulózban (MethocelR) szuszpendált vizsgálni kívánt vegyülettel vagy 0,2 ml hatóanyagot nem tartalmazó 0,5%-os MethocelR oldattal kezeltük. A szuszpenzió 30 mg/ml (600 mg/kg) hatóanyagot tartalmazott. Az egereket 7—10 napon keresztül naponta megfigyeltük, és rögzítettük az elhullást. A kontroll csoport és a kezelt csoport közötti szignifikáns eltérés meghatározására a módosított Mantel— Naenzel-módszer és a chí-négyzet módszer kombinációját használtuk. A 3,84-nél nagyobb chi-négyzet értékeket szignifikánsnak tekintettük (95%-os megbízhatósági szint). Bizonyos vegyületek állatokra gyakorolt hatását a következő eljárással vizsgáltuk („folyamatos orális táplálás” módszere). 10—11 g-os egereket Coxsackie A21, HeLa sejteken tenyésztett vírussal kezeltünk, olyan koncentrációt használva, amely 10 nap alatt 80— 100%-os elhullást okoz, ha az egereket intraperitoneálisan 0,2 ml vírus készítménnyel kezeljük. Az egereket olyan diétára fogtuk, amely a vizsgálni kívánt vegyületet diszpergált állapotban tartalmazó, kereskedelmi forgalomban kapható rágcsáló malátatápból állt. A 0. napon a táp hatóanyag-koncentrációja 0,06 súly% volt. Az 1. napon az egereknek intraperitoneálisan 0,2 mlfegér adagban vírus készítményt adtunk. Rögzítettük a kontroll és a vizsgálati csoportban tapasztalt elhullást a kezelést követő 10 napon keresztül, és a kapott eredményeket a chi-négyzet próbával ellenőriztük. A 3,84-et meghaladó chi-négyzet értékeket úgy tekintettük, hogy a vegyület aktivitására mutatnak (95%-os megbízhatósági szint). A kapott eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. 2. táblázat A példa száma Cicotoxicitás* (Mg/ml) RV- 1A RV-2 Szövet tenyészet próba* * Cox Aj, RV—5 RV-8 RV-64 1. > 100 0,5 0,25 0,25 0,5 0,25 0,156 2. > 100 0,625 0,625 1,25 2,5 2,5 3. > 100 1,25 1,25 2,5 4. > 100 « 0,625 « 0,625 0,625 < 0,3 < 6 5. > 100 NA 50 <6,25 6. 100 NA « 6,25 <6,25 7. 50 NA 6,25 <6,25 8. > 100 NA 12,5 <6,25 9. > 100 NA NA < 6,25 10. > 100 ± 50 NA < 6,25 11. > 100 NA ± 100 12,5 12. 25 ± 3,125 1,6 1,6 13. > 50 6,25 < 3,125 < 3,125 6,25 0,3125 0,625 14. >50 3,125 0,3125 0,625 2 5 0,3125 0,625 15. > 50 6,25 3,125 3,125 6,25 3,125 6,25 16. > 50 12,5 3,125 12,5 6,25 3,125 NA 17. 10 2,5 1,25 1,25 18. 12,5 3,125 < 3,125 3,125 1,25 1,25 0,3125 19. 12,5 6,25 « 3,125 6,25 1,25 1,25 0,3125 20. 10 NA 2,5 ± 2,5 21. 10 0,625 <0,625 0,625 1,25 0,625 0,625 22. > 50 < 3,125 < 3,125 < 3,125 3,125 23. > 50 3,125 < 3,125 6,25 « 6,25 <6,25 3,125 24. > 50 3,125 « 3,125 12,5 3,125 « 3,125 3,125 25. > 50 6,25 3,125 NA 6,25 3,125 25 26. > 20 NA 1,25 10 27. 12,5 2,5 0,625 1,25 0,625 1,25 0,625 28. > 20 NA 2,5 10 29. > 20 t 10 1,25 ± 5 30. > 20 2,5 2,5 NA 31. > 20 2,5 1,25 5 3,125 < 3,125 3,125 *Citotoxicitáson a vegyületeknek azt a ,ug|ml-ben kifejezett koncentrációját értjük, amely toxikus a sejtekre. **A vegyületek legkisebb koncentrációja (,ug/ml), amely 50(r-os csökkenést okoz a citopatikus hatásban. ***A vizsgált vegyület súly%-ban megadott koncentrációja az állatok táplálékában. Az „NA” jelölés azt jelenti, hogy a vegyület nem volt aktív az adott vírussal szemben a kísérleti körülmények között. „<" jelentése „kisebb mint”, „>” jelentése „nagyobb mint , ,,< jelentése „kisebb vagy egyenlő”, „>” jelentése „nagyobb vagy egyenlő'”, „ t” jelentése „megközelítőleg’ . Az üre ;en hagyott helyek azt mutatják, hogy a kísérletet nem hajtottuk végre. 7
