183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 Eljárás: 1. FFB-ben, illetve kontroll vizeletben a következő HCG oldat hígítási sorozatot készítettük el: 4000, 1000, 250, 62,5, 15,6 és 3,9 m IU (immuno-vizsgálat)/ml. 2. Az iménti oldatok, tiszta FFB és kontroll vizelet 0,1 ml-es részleteit átpipettáztuk egy MicroelisaR lap lyukjaiba, melyeket előzőleg az 1.3 pontban ismertetett eljárással nyúl anti-HCG ímmunoglobulinnal vontunk be. Mindezt két párhuzamos vizsgálattal végeztük el. 3. A lapot megfelelő módon lezártuk, majd 3,5 órán át inkubáltuk vízgőzzel telített atmoszférában 37 °C-on. 4. Leszívtuk a lyukakat, mindegyik lyukba 0,3 ml I mosópuffert pipettáztunk, majd ismét leszívtuk. 5. Mindegyik lyukba 0,1 ml konjugátot pipettáztunk. 6. Elvégeztük a 3. pontban ismertetett inkubálást, de 18 órán át. 7. Leszívtuk a lyukakat, a lyukakban vizuálisan kiértékeltük a színt és/vagy mindegyik lyukba 0,3 ml II mosópuffert pipettáztunk. Leszívás után még kétszer megismételtük a műveletet. 8. Mindegyik száraz lyukhoz hozzáadtunk 0,12 ml etanolt, enyhén összeráztuk, vizuálisan kiértékeltük a színt és/vagy megmértük az extinkciót 516 nm-en (=^max)Amennyiben a fenti eljárás során ismeretlen HCG-tartalmú minták is jelen vannak, a HCG-koncentráció vizuálisan könnyen megbecsülhető; de kívánt esetben pontosabb meghatározást is elvégezhetünk az extinkció mérésével és a standard görbével való összehasonlítással. Az így' meghatározott, HCG-re vonatkozó standard görbék vizeletben (sötét háromszögekkel jelölve) és FFB- ben (sötét körökkel jelölve) az 1. ábrán láthatók. A [kontroll + 2 X standard deviáció (SD)] szerint meghatározott kimutatási határ FFB-ben 3,9 m IU (immuno-vizsgálat)/ml, vizeletben pedig 15,6 IU (immuno-vizsgálat)/ml. 1.5 HCG meghatározása női vizeletben a terhesség detektálása céljából Reagensek: lásd az 1.4 pontot. Eljárás: Megegyezik az 1.4 pontban ismertetettekkel, csak a megfelelő vizeletmintákat használva (amelyek adott esetben hígítva lehetnek). Az eredményeket az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Minta *lígítás PregnosticonR „All-in” teszt Vizuális A5 1 6 HCG-koncentráció 1374 hígítatlan + + 0,588 4 000 1374 1 : 10 + + 0,595 40 000*) 1130 hígítatían + + 0,659 4 000 305 hígítatlan + + 0,707 4 000 726 hígítatlan-0,057 80 546 hígítatlan-0,043 65 1123 hígítatlan —-0,047 65 *>A hígítatlan mintában. A terhesség fennállásával kapcsolatban levont következtetések összhangban vannak a PregnosticonR „All-in” terhességi teszttel kapott eredményekkel. Ez utóbbi tesztben „+”=>1000 lU/ml és „-”=<500 lU/ml. 2. példa Az 1. példában ismertetettek szerint jártunk el, csak a diszperziós színezék/anti—HCG konjugátokat úgy állítottuk elő, hogy kolloid nyomjelzőkként ResolinR Brilliant Blue RRL-t, valamint SamaronR Brilliant Red H6GF, SamaronR Brilliant Yellow HIOGF, PalanilR Luminous Red G és PalanilR Luminous Yellow G fluoreszcens diszperziós színezékeket használtunk. A megfelelő Amax értékek a 9. példában találhatók. A HCG hígítási sorozatát pufferben készítettük el. A standard eljárással való összehasonlításban vizsgáltuk az inkubációs időtartamok csökkentését: 2,5 órás HCG inkubálási időtartam és 2,5 órás konjugát inkubálási időtartam 6,5, illetve 18 óra helyett. 0,02—0,25 mIU HCG/ml-es kimutathatósági határt kaptunk. Ez igen jó érték a többi rendszerrel való összehasonlításban: RIA: 2 mIU HCG/ml (kimutathatósági határ: /90% kötő + 2 X SD/ HCG-koncentrációnál); EIA: 20 mIU HCG/ml (kimutathatósági határ: mint a RIA-nál); SPIA: (Szol részecskés immunvizsgálat) 0,25—1 mIU/ml (kimutathatósági határ: Kontroll + 2 X SD) (kolorimetriás detektálás); rév—HAI: (fordított hemagglutináció-gátlás) 10-20 mIU/ml (kimutathatósági határ: a mintában a HCG-koncentráció szignifikáns változásokat mutat). Ezen túlmenően a teljes vizsgálati időtartamot 24,5 óráról 5 órára csökkentettük, amin a kimutathatósági határra nézve csak csekély hatással volt (a Samaron Brilliant Red H6GF esetében). A fluoreszcens diszperziós színezékeket vizsgáltuk abból a célból, hogy az abszorbancia mérése helyett a fluoreszcencia mérésével javítsuk a kimutathatósági határt. Szignifikáns javulást tapasztaltunk a SamaronR Brilliant Yellow HIOGF és a PalanilR Luminous Yellow G esetében, ezzel szemben a SamaronR Brilliant Red H6GF és a PalanilR Luminous Red G színezékek hatástalanoknak bizonyultak. 3. példa Hepatitis B felületi antigén (HBsAg) vizsgálata DIA - va l; sz end vi cs-vizsgála t 3.1 Színezék szol előállítása \z 1.1 pontban megadottak szerint jártunk el, de kolloid nyomjelzőkként PalanilR Red BF és SamaronR Brilliant Red H6GF diszperziós színezékeket használtunk. A megfelelő Amax értékek a 9. példában találhatók. 3.2 Bárány-!anti -HBsAg) IgG/színezék konjugát előállítása Az 1.2 pontban megadottak szerint jártunk el, de ny íl anti-HCG IgG helyett bárány-(anti—HBsAg) immonoglobulinokat használtunk. 3.3 MicroelisaR lapok bevonása bárány-fanti-HBsAg) IgG-nal Az 1.3 pontban megadottak szerint jártunk el, de nyíl immunoglobulinok helyett bárány immunoglobulinokat használtunk. 3.4 Standard görbék meghatározása HBsAg-re fad és ay altípusokra) A 4—1000 ng/ml koncentrációtartományban elkészítettünk egy hígítási sorozatot a HBsAg-re (ad és ay), melyhez hígítóként humán negatív kontrollszérumot 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
