183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 BSA-val; a konjugát ily módon történő bevonása várhatóan annak stabilitásának fokozódásához vezet, ezért hátrányos lesz azoknál a konjligátoknál, amelyeket a DIA/agglutinációs eljárásban szándékozunk felhasználni. A különböző mennyiségű BSA-val bevont konjugátokat, illetve a BSA bevonattal nem ellátott konjugátokat összehasonlítottuk az agglutinációs vizsgálatban. A legrövidebb vizsgálati időszakban a BSA nélküli konjugát mutatta a legnagyobb szenzitivitást és a legalacsonyabb ki muta tható sági határt, és kellőképp stabilis volt ahhoz, hogy konstans tiszta értéket adjon. 12.3.2 Optimális IgG koncentráció a konjugát előállítása során A bevonás során különböző IgG koncentrációkat használva PalanilR Red BF/anti HCG konjugátokat állítottunk elő, melyeket mintánként egy 5 lll/ml-es konstans HCG koncentráció (vagy 0,42 IU/ml teljes vizsgálati térfogat) alkalmazásával az agglutinációs vizsgálatban osztályoztunk. Úgy tapasztaltuk, hogy a konjugát előállítása során az optimális IgG koncentráció egy A]3c0m=5 értéknek megfelelő szolkoncentrációnál 0,033 mg/ml reakcióelegy. 12.3.3 A 2-es pH-értékre beállított IgG inkubálásának hatása a konjugát előállítása előtt Nyúl anti-HCG IgG oldat (4-5 mg/ml egy 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH=7,0) pH-értékét beállítottuk 2,0-ra. és 1 órán át inkubáltuk 4°C-on; ezután a pH-t, 7,4-re állítottuk be, és az IgG oldatot konjugát előállítására használtuk fel. A konjugát szintézise során a 2-es pH-ra beállított IgG koncentrációját változtattuk, és a különböző konjugátokat a 12.3.2 pontban megadottak szerint vizsgáltuk.. Optimálisnak találtuk a 0,033 mg 2-es pH-jú IgG/ml reakcióelegy koncentrációt, az A53c0m=5 értéknek megfelelő szolkoncentrációnál. A natív IgG-n és a 2-es pH-ra beállított IgG-n alapuló konjugátoknak az összehasonlítása világosan kimutatta, hogy az utóbbi előnyösebb az agglutinációs vizsgálatban mutatott reaktivitását tekintve: IgG konjugátbar. HCG Csökkenés az A? 3c0m értékben |%| i IU / m 11 4 óra után 18 óra után natív IgG 2,5 6 21 2-es pH-ra 5 13 63 beállított IgG 2,5 14 74 5 28 100 12.3.4 Adalékanyagok hatása a konjugátok reaktivitására A minta hozzáadását megelőzően egy destabilizáló szernek (például MgS04-nak) a konjugáthoz történő hozzáadása csökkentheti a reakcióidőt és/vagy az agglutinációs vizsgálat kimutatási határát, különösen az önmagukban igen stabilis konjugátok esetében. 5228513 (por) és 4742893 (nedves diszperzió) színezék alapú anti— HCG/PalanilR Red BF konjugátokat MgS04 hígítási sorozatával inkubáltunk, így egy 0—20 mmól MgS04/l teljes vizsgálati elegy végső koncentráció tartományt kaptunk, és rendszeres időközökben meghatároztuk az As3com értékét. Úgy találtuk, hogy az 1,2, illetve 9,5 mmól MgS04/I teljes vizsgálati elegy koncentrációk összeegyeztethetők a konjugátok még megfelelő stabilitásával (2 óra elteltével az A] 3c0m csökkenése 0,1 — 0,2-nél kisebb). HCG FFB-vel készült hígítási sorozatát (lásd 1,4 pontot; 0—5 IU/ml minta) anti-HCG/PalanilR Red BF (4742893) konjugáttal — amely egyes esetekben 9,5 mmól/1 teljes vizsgálati elegy koncentrációban tartalmazott MgS04-ot — inkubáltuk. A MgS04-ot nem tartalmazó konjugát A'^oTM értéke a tiszta mintához képest csak kis mértékben csökkent, míg MgS04 jelenlétében a tiszta mintáétól szignifikánsan különböző, csökkent abszorbancia volt megfigyelhető: MgSO, | mikronról/1 teljes vizsgálati elegy 1 HCG 1 IU/ml 1 Az A* 3c„m csökkenése 2,5 óra után \7o] 0 2,5 3 9,5 2.5 13 0 5,0 4 9,5 5,0 21 12.3.5 Anti-HCG/PalanilR Red BF konjugát (2-es pH-ra beállítva) reaktivitása MgS04 jelenlétében PalanilR Red BF konjugátokkal és egy HCG hígítási sorozattal (0—4—IU/ml minta) vizsgáltuk a 12.3.3/12.3.4 pontokban ismertetett kombinált hatásokat. A kapott kimutatási határokat (amelyet a [tiszta — 2xSD] kifejezéssel egyenlő hatásjelet létrehozó HCG koncentrációként definiáltunk) az alábbiakban összefoglaltuk: PalanilR Red BF 120 IU/1 (20 óra); 5228513 (por) 400 IU/1 ( 4 óra);- PalanilR Red BF 280 IU/1 (20 óra); 4742893 (diszperzió) 1300 IU/1 ( 4 óra). A SPIA/agglutináció kimutatási határa 100 IU/1 (kolorimet ias detektálás 2 óra elteltével). 12.3.6 A szemcseméret hatása a konjugát reaktivitására A teljes színezék diszperzió egyetlen frakciójával — vagyis az 1000-1100 g-vel (9800—10 800 N/kg) végzett cent rifugáláskor a szupernatáns folyadékban visszamaradt anyaggal, amelynek a szemcseátmérője körülbelül < 2 mikrométer — elvégeztük az összes eddigi kísérletet. A szemcseméret hatását továbbá úgy vizsgáltuk, hogy előállítottuk a PalanilR Red BF különböző ,^-frakciónak” anti-HCG konjugátjait, és ezeket egy HCG agglutinációs vizsgálatban vizsgáltuk. Optimális eredményeket szolgáltató szignifikáns hatásokat figyeltünk meg (lásd 4. ábra) az 1500 és 2500 g között elkülönített színezék-frakciók esetében. A 4. ábrán a 200—500 g-frakciónak megfelelő pontokat háromszöggel, az 500— 1500 g-frakciónak megfelelő pontokat körökkel, az 1500—2500 g-frakciónak megfelelő pontokat sötét négyzettel, a 2500—3500 g-frakciónak megfelelő pontokat sötét háromszöggel, a 3500-^1500 g-frakciónak megfelelő pontokat pedig sötét körrel jelöltük, 13. példa Diszperziós szinezék/immunoglobulin konjugátok liofilizálása ; stab ilitás Egy PalanilR Red BF/nyúl anti-HCG konjugátot egy, az alábbi alkotórészeket tartalmazó vizes diszperzióból (A'3c0m 5) liofilizáltunk: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
