183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 201 2 a metilészterek eíegyét szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Eluálószerként rendre kloroformot, 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol elegyet, végül 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol elegyet használunk fel. A kívánt 7a-hidroxi-3,l 2-diketo-5/3-kolánsavmetilészter a kloroformos eluátumban jelenik meg. Az eluálást 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel folytatva először a melléktermékként képződött la, 12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsav oldódik le;a további eluátumfrakciók a kívánt 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3- kolánsav-metilésztert tartalmazzák. Végül az eluálást 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel fejezzük be; ekkor a kólsav-metilésztert oldjuk le az oszlopról. A kapott metilésztereket ismert módon, hidrolízissel alakíthatjuk át a szabad savakká. Abban az esetben, ha a fermentációt Brevibacterium CA-6 törzzsel vagy Corynebacterium CA-53 törzzsel végeztük, a termékeket például a következőképpen különíthetjük el: A termékek és a kólsav elegyét közvetlenül felvisszük egy szilikagéllel töltött oszlopra, és az oszlopot először 98:2, majd 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel eluáljuk. A kívánt 7a-hidroxi-3.12- diketo-5|3-kolánsavat a 98:2 térfogatarányú kloroform : etanol elegy oldja le az oszlopról. Az eluálást 97:3 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel folytatva először a melléktermékként képződő 7a-hidroxi-3.12- diketo-A4-kolénsavat oldjuk le; a további eluátumfrakciók a kivánt 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavat tartalmazzák. A találmány szerinti eljárással előállított 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsavat vagy sóit Huang Minion módszerrel redukálva könnyen átalakíthatjuk a kiváló epekőoldó hatással rendelkező kenodezoxi-kólsawá (CDCA). A 7a-hidroxi-3,12-diketo-5|3-kólsavat vagy sóit könynyen átalakíthatjuk dezoxi-kólsawá. Miként már közöltük, a dezoxi-kólsav a progeszteron és az adreno-kortikoszteroid-származékok szintézisének értékes kiindulási anyaga. A dezoxi-kólsav előállítása során a 7a-hidroxi-3.12- diketo-5|3-kólsavat először vízelvonásnak vetjük alá, majd a kapott terméket ismert módon hidrogénezzük. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A. példa Mutánsok előállítása Arthrobacter CA-35 törzset (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) ferde tenyészetben 0,5 % nátriumhidroxidot, 5,0 % kólsavat, 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmazó táptalajon („A” táptalaj) tenyésztünk. A tenyészetből platinakacsnyi mintát veszünk, és a mintával 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „B” tápközeget oltunk be. A „B” tápközeg 1 % nátriumhidroxidot, 10 % kólsavat, 0,2 % ammóniumnitrátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfátheptahidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz. Az elegyet rázás közben 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Az így kapott tenyészetből 0,3 ml térfogatú mintát veszünk, és a mintával egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „C” tápközeget oltunk be. A „C” tápközeg 0,05 % nátriumhidroxidot, 0,5 % kólsavat, 0,5 % glükózt, 0,2 % ammónium-nitrátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikáliumhidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfát-heptahidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz. Az elegyet rázár- közben 15-16 órán át 30°C-on inkubáljuk. A logaritmikus szaporodási szakaszban lévő mikroorganizmus-sejteket 0,45 /I pórusméretű membránszűrőn aszeptikus körülmények között kiszűrjük, 20 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 7,0) mossuk, majd 25 ml, a mosófolyadékkal azonos pufferoldatban szusz - pendáljuk. A mutagén kezelést a következőképpen végezzük: 4 ml sejtszuszpenziót egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltünk, a sejtszuszpenzióhoz 50 pg/ml végső koncentrációnak megfelelő mennyiségű N-metil- N'-nítro-N-nitrozo-guanidint adunk, és az elegyet rázás közben 45 percig 30 °C-on inkubáljuk. Ilyen körülmények között az Arthrobacter CA-35 törzs sejtjeinek körülbelül 80 %-a elpusztul. A kezelt sejteket 0,45 p pórusméretű membránszűrőn aszeptikus körülmények között kiszűrjük, 20 ml 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH = 7,0) mossuk, majd 25 ml, a mosófolyadékkal azonos pufferoldatban szuszper.dáljuk. A kapott sejtszuszpenziót steril normál vizes nátriumklorid-oldattal hígítjuk, majd agar-lemezeken terítjük szét. A felhasznált táptalaj („D” táptalaj) 0,1 % nátriumhidroxidot, 1,0 % kólsavat, 0,2 % ammóniumnitrátot, 0,2 % kálium-dihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfátheptahidrátot, 0,01 % élesztőkivonatot és 1,5 % agart tartalmaz. A lemezekre annyi sejtszuszpenziót viszünk fel, hogy minden egyes lemezen 300 -500 telep képződjék A lemezeket 4 napon át 30°C-on inkubáljuk. A kialakult, tűhegynyi telepeket elkülönítjük, majd agarlemezen 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált táptalaj („E” táptalaj) 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmaz. Az „E” táptalajból készített lemezeken fejlődő telepeket replika-módszerrel a „D” táptalajból készített lemezekre visszük át, majd 20 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Az „E” táptalajról elkülönített azon telepeket, amelyek a következő tenyésztési lépésben a „D” táptalajból készített lemezen nem növekednek, ferde agar-tenyészetben 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált táptalaj („F” táptalaj) 0,1 % nátriumhidroxidot, 1,0% kólsavat, 0,5 % peptont, 0,5 % élesztőkivonatot, 0,5 % nátriumkloridot és 1,5 % agart tartalmaz. A ferde tenyészetből platinakacsnyi mintát veszünk, a mintával egy 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml tápközeget oltunk be, és az elegyet rázás közben 3 napon át 30 °C-on inkubáljuk. A felhasznált tápközeg („G” táptalaj) 0,5 % nátriumhidroxidot, 5,0 % kólsavat, 0,5 % glükózt, 0,2 % ammónium-nitrátot, 0,2 % káliumdihidrogénfoszfátot, 0,5 % dikálium-hidrogénfoszfátot, 0,02 % magnéziumszulfát-heptahidrátot és 0,01 % élesztőkivonatot tartalmaz. A „G” tápközegben felhalmozódott termékeket vékonyrétegkromatográfiásan elemezzük. A törzset, amely az elemzési adatok szerint szelektíven 3a,7a-dihi iroxi-12-keto-5/3-kolánsavat, illetve e sav sóit termeli, Arthrobacter CA-35-M-965-3 törzsnek neveztük el. A fenti eljárást a következőkben ,,M” eljárásnak nevezzük. Ezután az „M” eljárást az Arthrobacter CAJ 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
