183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 201 2 A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás az (I) általános képletű kolánsav-származékok előállítására — ahol OH X oxigénatomot vagy-'';, csoportot, jelent, és R jelentése hidrogénatom, alkálifém-atom vagy alkáliíöldfém-atom. A találmány szerinti eljárással az (I) általános képletíí kolánsav-származékokat rövid idő alatt, nagy hozammal állíthatjuk elő úgy, hogy egy szubsztrátűmként kólsavat vagy kólsav-sót tartalmazó fermentlében specifikus mikroorganizmusokat tenyésztünk. Az X helyén-^csoportot tartalmazó (I) általános képletíí kolánsav-származék, az,az a 3a,7a-dihidroxi-12- keto-5|3-kolánsav és sói az epekőoldó hatással rendelkező kenodezoxi-kólsav (CDCA) előállításának értékes közbenső termékei. Az X helyén oxigénatomot tartalmazó (I) általános képletíí kolánsav-származék, azaz a 7 ahidroxi-3,12-diketo-50-kolánsav és sói a dezoxi-kólsav előállításában használhatók fel közbenső termékekként. A dezoxi-kólsav a progeszteron és számos adrenokortikoszteroid-származék előállításának értékes kiindulási anyaga. Már korábban is ismertettek mikrobiológiai eljárásokat az (I) általános képletíí kolánsav-származékok előállítására, amelyekben szubsztrátumként kólsavat vagy kólsav-sókat használtak fel. A Hayakawa és munkatársai által kidolgozott eljárás szerint a 3a,7a-dihidroxi-l2- keto-5j3-ko)ánsavat Streptomyces gelaticus 1164 törzs felhasználásával állítják elő [The Journal of Biochemistry (Japan), 44 (2), 109—113 (1957); Proceedings of Japan Academy, 32, 519—522 (1956)]. Hasegawa és munkatársai eljárást ismertettek 3a,7a-dihidroxi-12- keío-5|3-ko!ánsav előállítására Aspergillus cinnamomeus HUT 2026 törzs felhasználásával [Hiroshima Journal of Medical Science, 8 (3), 277—283 (1959)]. A Kikuchi és munkatársai által közölt eljárásban a 3a,7a-dihidroxi-12- keto-ST-kolánsav előállításához Staphylococcus epiderrp.idis H-l törzset alkalmaznak [Journal of Biochemistry, 72 (1), 165—172 (1972)]. A Hayakawa és munkatársai által ismertetett, Streptomyces geiaticus 1164 törzset felhasználó eljárás 7a-hidroxi-3,12-diketo-5j3-kolánsav előállítására is alkalmas [Proceedings of Japan Academy, 32, 519-522(1956)]. Valamennyi ismert eljárás közös hátránya, hogy a fermentlé a kólsav szubsztrátumot kis - például 10 g/l-t meg nem haladó — koncentrációban tartalmazza. Kísérleteink szerint a kolánsav-származékok előállítására irányuló ismert mikrobiológiai eljárásokban azért kell a kólsav koncentrációját kis értéken tartani, mert ellenkező esetben (20 g/l-t meghaladó kólsav-koncentráció esetén) a felhasznált mikroorganizmusok visszafejlődnek vagy alig növekednek. Az ismert mikrobiológiai eljárások további hátránya, hogy a tenyésztéshez igen hosszú időt igényelnek. Olyan eljárás kidolgozására van tehát szükség, amellyel a kolánsav-származékok rövid idő alatt nagy hozammal állíthatók elő. Azt tapasztaltuk, hogy az Arthrobacter, Brevibacterium és Corynebacterium nemzetségbe tartozó egyes mikroorganizmusok széles határok között változó mennyiségű kólsavat vagy kólsav-sót tartalmazó táptalajokon is növekednek, és nagy hozammal, rövid idő alatt termelnek (I) általános képletű kolánsav-származékokat. A találmány tárgya tehát eljárás fi) általános képletíí kolánsav-származékok előállítására mikrobiológiai úton. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy kólsavat vagy egy kólsav-sót tartalmazó tápközegben az adott tápközegen növekedni képes, (1) általános képletű kolánsavszármazékokat termelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmust, nevezetesen az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 vagy Corynebacterium CA-53 törzsek valamelyikét, illetve ezek mutánsait vagy variánsait tenyésztjük, majd a kapott termékeket elkülönítjük. A találmány szerinti eljárásban talajból elkülönített mikroorganizmusokat, azok természetes mutánsait, illetve az azokból mutagén kezeléssel (például röntgensugárzással vagy ultraibolya fénnyel végzett besugárzással, mutagén vegyszerek, így N-metil-N-nitro-N-nitrozoguanidin, 4-nitro-kinolin-N-oxid, akriflavin vagy etilmetán-szulfonát felhasználásával, illetve e módszerek kombinálásával) kialakított mutánsokat használhatjuk fel. A kólsavat vagy kólsav-sókat tartalmazó tápközegeken (I) általános képletű kolánsav-származékokat termelő, általunk elkülönített mikroorganizmusokat a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology intézetben (Japán; a továbbiakban: FERM), illetve az Amerikai Egyesült Államok-beli American Type Culture Collection törzsgyűjteményben (a továbbiakban: ATCC) helyeztük letétbe. A letétbe helyezett törzsek a következők: Arthrobacter CA-35 (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651), Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35-A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653). Arthrobacter CA-35-A849 (FERM-P No. 5524, ATCC No. 31654), Arthrobacter CA-35-A-1071-15 (FERM-P No. 5525, ATCC No. 31655), Arthrobacter CA-35-A-1448 (FERM-P No. 5526, ATCC No. 31656). Arthrobacter CA-35-A-1475 (FERM-P No. 5527, ATCC No. 31657), Arthrobacter CA-35-A-l 766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658), Arthrobacter CA-35-M-965-3 (FERM-P No. 5529, ATCC No. 31659), Arthrobacter CA-35-Y-37-12 (FERM-P No. 5530, ATCC No 31660), Brevibacterium CA-6 (FERM-P No. 5144, ATCC No. 31661) és Corynebacterium CA-53 (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662). Az Arthrobacter CA-35, Brevibacterium CA-6 és Corynebacterium CA-53 törzs természetből elkülönített („vad”) törzs; a további kilenc Arthrobacter törzs pedig az Arthrobacter CA-35 törzs mutánsa. Az Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzset ultraibolya fénnyel végzett besugárzással alakítottuk ki, míg az Arthrobacter CA-35 törzs további nyolc mutánsa esetén az alaptörzset N- metil-N -nitro-N-nitrozo-guanidinnel kezeltük. A felsorolt törzsek morfológiai, tenyésztési és élettani jellemzőit az 1. táblázatban foglaljuk össze, összehasonlítás céljából az Arthrobacter CA-35 törzzsel rokon Arthrobacter simplex IÁM 1660 törzs megfelelő adatait is feltüntetjük. Az 1. táblázatban említett BCP-tej táptalajt úgy készítjük, hogy a tejből centrifugálással eltávolítjuk a zsiradékot, majd a sovány tejhez brómkrezol-bíbort (BCP) adunk. A vizsgált mikroorganizmus növekedőképességét az indikátor (BCP) színváltozása jelzi. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
