183154. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 11ß-hidroxi-szteroidok előállítására
1 183 154 2 szert tartalmazó vízbe behívatjuk, A reakciónál jól alkalmazhatók a nem ionos emulgeálószerek, mint például a poliglikolok etilénoxi-adduktjai, vagy zsírsavészterei. Megfelelő emulgeálószerek még a kereskedelemben kapható Tegin(R), Tagat(R), Tween(R) és Span(R) nevű • nedvesítőszerek. Gyakran lehetséges ilyen módon a szubsztrátkoncentrációt növelni, de természetesen a találmány szerinti eljárástól különböző eljárásoknál is lehetséges, a fermentációs szakemberek által ismert módon, megnövelt szubsztrátkoncentráció alkalmazása. Az optimális szubsztrátkoncentráció, szubsztrátadagolás és a fermentációs időtartam az alkalmazott mikroorganizmustól és az alkalmazott szubsztrátumtól függ. Ezeket az értékeket, mint ahogyan az a mikrobiológiai úton történő szteroid átalakításoknál szükséges, általában az egyes esetekben előkísérletekkel kell megállapítani. A jelen találmány szerinti eljárással a II általános képletű megfelelő 11-dezoxi-szteroidokból például az alábbi 11/3,17alfa,21 - trihidroxi - 4 - pregnen - 3,40 - dión - -származékok állíthatók elő: 11/3,17alfa,2 l-trihidroxi-4-pregnen-3,20-dion, I l/8,17alfa,21-trihidroxi-l,4-pregnadien-3,20-dion, II ß, 17 alfa ,21 - trihidroxi-6alfa-metil-4-pregnen-3,20- -dion, 11 ß, 17alfa,2 l-trihidroxi-6-alfa-mctil-1,4-pregnadien-3,20-dion, 1 l/3,17a,21-trihidroxi-D-homo-4-pregnen-3,20-dion, 11/3,17 a, 21 -trihidroxi-D-homo-1,4-pregnadien-3,20- -dion. Az alábbi példák a jelen találmány szerinti eljárás további magyarázatául szolgálnak. 7. példa a) 8 g piridinium-tozilátnak és 80 g 17a,21-dihidroxi-4-pregnen-3,20-dionnak 560 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 3,5 1 benzollal felhígítjuk, majd 120 °C-os fürdőhőmérsékletnél egy vízleválasztóval ellátott készüléken t,5 1 benzolt ledesztillálunk. A forró reakcióelegyhez lassan 192 ml ortoecetsavas trietil-észtert adunk hozzá, és további egy órán át a benzolt és más illékony reakciókomponenseket a reakcióelegyből kidesztilláljuk. Ezután 96 ml piridint adunk hozzá, és 60 °C-os fürdőhőmérsékletnél vízsugárszivattyúval létesített vákuumban 2 óra alatt teljesen beszárítjuk. A viszszamaradó olajos anyag gyorsan kikristályosodik, és ily módon sárga kristályos anyagként 113 g 17a,21-(l-etoxi-etilidén-dioxi(-4-pregnen-3,20-diont nyerünk, melynekolvadáspontja 89-90 °C. b) Egy 2 1-es Erlenmeyer-Iombikban lévő, 30 percig autoklávban sterilezett 500 ml tápoldatot, mely 3 % glikózt, 1 % kukoricalekvárt, 2 % NaN03-ot, 0,1 % KH2PO„-ot, 0,2 % K2HP04-ot, 0,05 % MgS04.7H20-t, 0,002 % FeS04.7H20-t és 0,05 % KCl-ot tartalmaz, Curvularia lunata (NRRL 2380) liofilizált tenyészetével beoltunk, és a lombikot 30 °C hőmérsékletnél rotációs rázóasztalon 60 órán át rázatjuk. Ezzel a tenyészettel (250 ml) beoltunk egy 20 1-es előfermentorban lévő, 121 °C-on és 2,1 atm nyomáson sterilizált 15 1 tápközeget, mely tápközeg 2 % glükózt és 2 % kukoricalekvárt tartalmaz, és amelynek pH-ját 6,5 értékre állítjuk be. Ezután Silikon SH-nak, mint habzásgátló anyagnak hozzáadása közben 29 °C hőmérsékletnél és 0,7 atm nyomásnál levegőztetve (10 1/perc) és kevertetve (220 ford/perc) ;24 órán át növesztjük, majd ennek a tenyészetnek steril rkorülmények között kivett 1,5 1-ével egy 20 1-es főfermentort beoltunk, melyben 14 I, a fentiek szerint sterilizált tápközeg van. Ez a tápközeg 3 % kukoricalekvárt és 0,7 % glükózt tartalmaz, és pH-ját 6,5 értékre állítjuk be. Az előfermentációval megegyező körülmények között lefolyó 12 órás növekedési fázis után 100 ml dimetil-formamidban oldott 7,5 g nyers 17a,21-(l-etoxi-etilidén-dioxi)-4-pregnen-3,20-diont, mely 6,43 g tiszta anyagot tartalmaz, adunk hozzá steril körülmények között, és tovább kevertetjük és levegőztetjük. A fermentációs folyamat alakulását oly módon követjük nyomon, hogy időnként mintát veszünk, ezt metilizobutil-ketonnal extraháljuk, és vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel analizáljuk. 38 óra alatt a szubsztrátum átalakulása befejeződik. A fermentlevet szűrjük, a szűrletet, valamint a kiszűrt micéliumot metilizobutil-ketonnal extraháljuk, az extrakt jmokat egyesítjük, majd először keringtető bepárlóban besűrítjük, és végül vákuumban 50 °C fürdőhőmérsékletnél forgó bepárló készülékben szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot meleg metil-alkoholban feloldjuk, a megmaradt oldhatatlan szilikonolajat szűréssel eltávolítjuk, és az oldatot újból szárazra pároljuk. A maradékot (9,4 g) 40 ml etil-acetátban melegítve feloldjuk, és először szobahőmérsékleten, azután mélyhűtve kristályosítjuk. A kikristályosodott terméket leszívatjuk, kevés hideg etil-acetáttal mossuk és 60 °C-on vákuum-szárítószekrényben 5 órán át szárítjuk. Ily módon 4,18 g hidrokortizont (1 1/3,17«,21-trihidroxi-4-pregnen-3,20-dion) nyerünk, melynek olvadáspontja 212—214 °C. Az anyalúgot aktív szénnel melegítjük, szűrjük és 15 ml-es térfogatra bekoncentráljuk. Lehűlés és szobahőmérsékleten egy éjszakán át tartó állás után további 0,7 g hidrokortizon kristályosodik ki, melynek olvadáspontja 208- 210 °C. Az összkitermelés az elméleti érték 87,1 %-a. 2. példa a) 7 g piridinium-tozilátnak és 70 g 17n,21-dihidroxi-4-pregnén-3,20-dionnak 560 ml dimetil-formamiddal készített oldatát 4,9 1 benzollal felhígítjuk, majd 130 °C-os fürdőhőmérsékleten vízleválasztóval ellátott készüléken 2,1 ! benzolt ledesztillálunk. Rövid lehűtés után 168 ml ortovajsavas trimetil-észtert adunk hozzá, majd 130 °C hőmérsékleten 1,5 órán belül a megmaradt benzolt is ledesztilláljuk. Az oldathoz 84 ml piridint adunk, és erős vákuumban, forgó bepárlóban szárazra pároljuk. így 103,8 g olajos 17a,21-(l-etoxi-butilidéndioxi)-4-pregnen-3,20-diont kapunk. b) Az lb) példában leírt reakciókörülmények között 7,5 g nyers 17a,21-(l-etoxi-butilidén-dioxi)-4-pregnen-3,20-diont, mely 6,3 g tiszta anyagot tartalmaz, Curvularia lunata tenyészettel 47 órán át fermentálunk. Feldolgozás és a szilikontól mentesített extraktum bepárlási maradékának etil-acetáttal való kikristályosítása 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
