183110. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szövetpótlásra felhasználható anyagok előállítására biológiai szövetekből
1 183 110 2 nyék között végezzük, miközben a bőr és a lemetszett börrétegek kiszáradását megakadályozzuk. A 20-40-10 6 m vastagságú bőrlebenyeket 7%os nedvességtartalomig liofilizáljuk, miközben a bőrlebenyek hőmérsékletét +20°C alatti, a liofilizáló kondenzor hőmérsékletét — 40 °C alatti hőmérsékleten tartjuk. A liofilizálás alatt a bőrt kisimított állapotban tartjuk. A liofilizált bőrt a kívánt méretre végjük, és tiszta körülmények között kettősfalú polietilén zacskóba csomagoljuk, a csomagolást rétegenként hőhatással egyesítjük (lehegesztjük). A csomagolás során a levegőt nem távolítjuk el, és nem cseréljük ki közömbös gázzal, pl. nitrogénnel, mint azt korábban tették, ill. szükségesnek tartották. A becsomagolt termék sterilizálását Co60 izotóp gammasugárzása segítségével végezzük 1 kGy/óra dózisteljesítménnyel és 35 kGy besugárzási dózissal, miközben a termék hőmérsékletét +30°C-ot meg nem haladó értéken tartjuk. Az ily módon sterilizált készítmény szobahőmérsékleten tárolható, és 2 évig felhasználható. Az eljárást ínszövetek esetén - értelemszerű változtatásokkal - hasonló módon hajtjuk végre. Bizonyos esetekben célszerű lehet a biológiai szövetet porított állapotba hozni és így felhasználni. 2. példa A példa sertés- vagy borjúcsontból készült, emberi csontszövet pótlására alkalmas anyag előállítására vonatkozik. Frissen vágott, fiatal (két évnél nem idősebb) állatból csöves és szivacsos állományú csontokat tiszta körülmények között húsipari módszerekkel elválasztunk a környező szövetektől. A kapott csontokat fiziológiás konyhasó-oldatban megmossuk, a csonthártyát és a szövetmaradványokat eltávolítjuk, fehér velőt tartalmazó csontokból eltávolítjuk a velőt is, és a velőürt is átöblítjük a fiziológiás konyhasó-oldattal. Amennyiben a feldolgozás nem közvetlenül a vágás után történik, úgy 24 órán át +4 és - 10 °C közötti hőmérsékleten tárolhatjuk a csontokat. Ezután a szükségletnek megfelelően daraboljuk a csontokat (például fűrésszel). Legtöbbször 20 — 30 cm3-es darabokra van szükség, de lehet igény 0,5 cm3-es darabkákra, sőt porított csontszövetre is. Az így előkészített csontszövetet zsíroldószerrel kezeljük, a zsírtartalmat szükség szerint (például 2%-ig) csökkentjük. Megjegyezzük, hogy porccal fedett csontrészeket nem használunk fel. Következő lépésben a csontdarabokat az 1. példában leírt módon liofilizáljuk. A liofiljzálásos tartósítás helyett mélyhűtést is alkalmazhatunk. Ebben az esetben az anyagot a felhasználásig - 70 °C hőmérsékleten tartjuk. Ilyen tárolás mellett 2 évig felhasználható az anyag. A liofilizálással tartósított készítményeket a felhasználás előtt 0,9%-os steril NaCl oldatban rehidráljuk, bőr esetében 5 - 10 percig, csont- és ínszövet esetén 2 — 5 óráig. Mélyhütéssel tartósított készítmények esetében felhasználás előtt - 70 °C-ról + 20 °C-ra emeljük az anyag hőmérsékletét. A melegedés ütemét nem kell szabályozni. A csontokat a szükséges 7%-os nedvességtartalom elérése után kettősfalú polietilén zacskóba vagy gumidugóval lezárható üvegedénybe helyezzük, a felhasználói igénynek megfelelő mennyiségben. A zacskó hőhatással történő rétegenkénti egyesítését, illetve az üveg lezárását szobalevegőn végezzük, tehát a lezárás után levegő marad a csomagoláson belül. A becsomagolt, hermetikusan lezárt termék sterilizálását az 1. példa szerinti módon, de 15 kGy besugárzási dózissal végezzük. A találmány szerinti eljárással előállított szövegpótló anyagok előnyös biológiai tulajdonságait az alábbiakban kísérleti eredményekkel szemléltetjük. Az idegen bőr a szervezetbe vagy (bőrátültetési eljárást alkalmazva) sebfelszínre helyezve a szervezet immun-reakcióját váltja ki, amely a testidegen bőr lelökődését eredményezi. A testidegen szövet által kiváltott reakció mérésének egyik lehetősége a transzplantációs területet ellátó nyirokcsomók sejtjei ún. „blasztos” reakciójának mérése. A találmány szerinti eljárás hatásának vizsgálata céljából patkányba ültettünk az eljárás egyes elemeivel, illetve a teljes eljárással kezelt sertésbőrt (1. ábra). Kimutattuk, hogy 3 H izotóppal jelzett timidin nyirokcsomó sejtekbe való felvétele alapján - amely a „blasztos” reakció mértékét jelzi - a bőr beültetését megelőzően végzett liofilizálással való kezelés a kiváltott reakciót jelentősen csökkenti (2. oszlop: mélyhűtött, 3. oszlop: liofilizált bőr által kiváltott reakció). Amennyiben a testidegen bőrt az eljárásunk egészének megfelelően kezeltük (4. oszlop), a kiváltott reakció a kontroll szintet (I. oszlop) - mikor beültetés nem történt - alig haladta meg. Az eredmény arra utal, hogy eljárásunkkal a bőrszövet igen kifejezett testidegenségét jelentős mértékben csökkenteni lehet. Ez a változás a kezelést megelőző állapothoz képest a készítmény célszerű alkalmazásánál jelentős előnyt eredményez. Az eljárásunk alkalmazásával bőrszövetből előállított, az égéskezelésben időleges biológiai kötözőanyagként felhasználható preparátum lehetőséget ad arra, hogy az égett sebet - akár heteken át is - a szükségletnek megfelelően a készítménnyel fedjük anélkül, hogy a szervezet nemkívánatos reakcióját váltanánk ki. Staphylococcus aureus baktérium kultúrák felhasználásával kimutattuk, hogy a találmány szerinti eljárással kezelt bőrszövet új tulajdonsággal bír a kezeletlenhez képest, mivel a találmány szerinti eljárással előállított preparátummal kezelve a baktérium kultúrát az gátolja a baktériumok osztódását (2. ábra, 5 sz. görbe). A szövetpótlás azon eseteiben — például csontnál — amikor a beültetett szövetrészlet az anatómiai és funkcionális egység helyreállítását is szolgálja, véglegesen részévé válik a szervezetnek, igen fontos kérdés, hogy a szervezetbe való beépülés mennyi időt vesz igénybe. Patkánykísérletben összehasonlítottuk, hogy az egyik szokásos módon, mélyhütéssel tartósított csontpreparátum, és a találmány szerinti eljárással tartósított csont beépülése mennyi időt vesz igény-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
