183078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a koleszterin-észteráx aktiválására
1 183 078 2 Előre megadott feltételek: 0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffer, Tergitol NPX, 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz. 5. példa , Tergitol NPX Elért az elegyben sebesség 0 0 extinkció/10 perc 2 0 ext./10 perc 5 0,029 ext./10 perc 10 0,042 ext./10 perc 15 0,049 ext./10 perc 20 0,039 ext./10 perc Optimum A rendszer határa 15 %0 0,049 extinkció/10 perc Az adjuvánsok hozzáadása 15 %0 Tergitol NPX-nél. 5.1. 2 mmól/liter 3,4-diklór-fenol és 1 térf% ciklohexa - non hozzáadása. Elért sebesség 0,058 extinkció/10 perc Emelkedés 118 %-ra. 5.2. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása. Elért sebesség 0,066 extinkció/10 perc Emié kedés 135 %-ra. 5.3. 1,4 térf% ciklohexanol hozzáadása. Elért sebesség 0,118 extinkció/10 perc Emelkedés 241 %-ra. c) Kisebb ionerősségű pufferok alkalmazása. Amint már említettük, nagyobb ionerősségű pufferok a detergensek koleszterin-észterázra gyakorolt aktiváló hatását elnyomják. A feltételek igényekhez képest lehető legszabadabb megválasztásának keretei között kívánatos, hogy az oldatban ne legyen nagy sótartalom. A következő példa mutatja, hogy a találmány szerint a sótartalom lényegesen csökkenthető. összehasonlítjuk a: 0,3 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffert és a 0,1 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát puffert. Alkalmas adjuvánsoknak a 0,1 mólos pufferendszerhez való hozzáadásával a sebességek annyira növelhetők, hogy elérik az adjuváns nélküli 0,3 mólos pufferrendszer magasabb összehasonlítási értékeit, és részben jelentősen meg is haladhatják azokat. 6 6. példa 15 °/00 Tergitol NPX, 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz. 6.1. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása. Rendszer Sebesség 0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 extinkció/10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./10 perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,053 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket meghaladja. 6.2. 1,4 térf% 4-metil-2-pentanol hozzáadása. 0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 ext./10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./10 perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,059 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket meghaladja. 6.3. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása. 0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,030 ext./10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,049 ext./10 perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,114 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket jelentősen meghaladja. 7. példa 10 %o Genapol OX-100/10 %0 nátrium-kaprilát, 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz.-7.1. 40 mmól (kb. 0,35 súly%) fenol hozzáadása. Rendszer Sebesség 0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,017 extinkció/10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./10 perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,053 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket eléri. 7.2. 1 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása. 0,1 mólos puffer adalél nélkül 0,017 ext./10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./lO perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,063 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket meghaladja. 7.3. 2 térf% ciklohexanol hozzáadása. 0,1 mólos puffer adalék nélkül 0,017 ext./10 perc 0,3 mólos puffer adalék nélkül 0,053 ext./10 perc 0,1 mólos puffer adalékkal 0,072 ext./10 perc. Az összehasonlítási értéket meghaladja. d) Detergensek alkalmazása kis koncentrációban. Ha egy detergens képes arra, hogy a koleszterinészterázt aktiválja, akkor ennek ezen tulajdonság teljes kifejtéséhez bizonyos koncentrációban jelen kell lennie a reakcióelegyben. Ez a detergens-optimum lényegesen függ a detergens fajtájától, és sok esetben kedvezőtlenül magas koncentrációtartományba eshet. Ezért más, további reakciókhoz szükséges enzimek esetében gátlások, és oldhatósági és egyéb okokból nehézségek léphetnek fel. A detergens-optimum alatt csaknem kielégítő aktiválás észlelhető. A feltételek lehető legszabadabb megválasztása érdekében azonban kívánatos, hogy lehetőleg sok különböző detergenst — magasabb koncentráció-optimummal rendelkezőket is — alkalmazhassunk. Az alábbi példák mutatják, hogy a találmány szerint lehetséges a koncentráció-optimum reakciósebességét kevesebb detergenssel is elérni és túllépni, miáltal detergenst takarítunk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
