183078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a koleszterin-észteráx aktiválására
1 183 078 2 A találmány tárgya eljárás és reagens koleszterinészteráz aktiválására, különösen észterek reakcióelegyekben való enzimes reagáltatásánál. Ilyen reakcióelegyeket többek között a klinikai-kémiai analitikában és az élelmiszerkémiai analitikában használnak. Koleszterin-észteráztól függő tesztek tervezésénél ismert probléma a drága enzim megtakarítása, nagyobb reakciósebesség elérése és az előírt szempontoktól függően a detergensek és pufferok fajtáinak és mennyiségének lehetőleg szabad megválasztása. Olyan pufferolt közegben, amely további komponenseket nem tartalmaz, a koleszterin-észteráz szubsztrátjaival szemben semmilyen vagy csak nagyon csekély aktivitást fejt ki. Ezért szükséges, hogy az enzim részére olyan aktiváló adalékokat találjunk, amelyekkel az észterhasítás gyorsítható. Ilyen aktiváló adalékokként ismeretes néhány detergens, például epesavak, Triton X-100, Thesit. [Lásd 3 884 764 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; 24 09 696, 25 12 602, 25 12 585 sz. német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozatali irat; 2 505 712 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás; Biochim. Biophys. Acta 270, 156-166(172)]. A közeg magasabb sótartalma elnyomja ennek aktiváló hatását. Tehát nem minden pufferrendszer felel meg azonos módon. Ugyanez áll fenn a detergensekre. Találunk bizonyos körülmények között jó és kevésbé jó hatásúaktól kezdve olyanokat is, amelyek egyáltalán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak. Többnyire nem mondható meg előre, hogy ebből a szempontból melyik detergens megfelelő. Az aktiváló detergensek közös tulajdonsága, hogy egy adott közegben, adott koncentrációtartományban fejtik ki. optimális aktiváló hatásukat. Az optimumok kedvezőtlenül magas koncentrációtartományokban is lehetnek. Az optimumokon kívül a viszonylag drága enzim nagyobb mennyiségben való hozzáadása nem eredményez optimális módon magasabb reakciósebességeket. Ezenkívül aktivitásnövelések a detergens-tartalom optimálásával és az ionerősség növelésével csak viszonylag szűk határok között érhetők el. Mivel a számításba jövő reakcióelegyek rendszerint még további enzimeket és szubsztrátokat tartalmaznak a további és az indikátorreakciókhoz, a puffer és a detergens kiválasztásánál, valamint a mindenkori hozzáadandó mennyiségek optimalizálásánál semmilyen szabad választási lehetőség nincs adva. A reakciókörülmények megállapításánál továbbá mindig tekintetbe kell venni az összes reakciópartner egymásközti kölcsönhatását, különösen más enzimek esetleges gátlását vagy hátrányos stabilitásbefolyását detergensek és/vagy nagy ionerősségek miatt. Egy tesztrendszer tervezésénél továbbá oldhatósági határokra és a galenusi gyógyszerészet problémáira is ügyelni kell. Az utóbbi esetben a főként folyékonytól viaszosig változó állagú detergensek ritkán adhatók hozzá az aktiváláshoz szükséges mennyiségekben szilárd anyagkeverékekhez, amelyeknek száraznak és szórhatóknak kell lennie. Ennek különösen cseppreagenseknél van jelentősége. Végül tekintetbe kell még venni, hogy a legtöbb számításba jövő detergens nem jól definiált vegyületként, hanem anyagkeverékként fordul elő. Következésképpen sarzseltérések lehetségesek, amelyek az aktiváló hatásnál is észrevehetők. Ezért nagyon hátrányosan hathat, ha az aktiválás egyedül egy detergenstől függ. Ennek következtében áll fenn jelentős igény további reagensekre és eljárásokra a koleszterin-észteráz aktiválására. A találmány feladata, hogy a fentemlített hátrányokat elhárítsa, és a fenti célra olyan eljárást és reagenst biztosítson, amelynél koleszterin-észterázt takarítunk meg, meghatározott körülmények között nagyobb reakciósebességek érhetők el, kisebb ionerősségeknél dolgozhatunk, detergensek csak minimális koncentrációban szükségesek, és olyan detergensek is alkalmazhatók, amelyek egyedül csak nagyon gyenge vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak. Ezt a feladatot a találmány szerint koleszterínészteráznak iontartalmú oldatokban, detergensek hozzáadásával való aktiválására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy felületaktív szerként egy (3—25 etoxi-csoportot tartalmaz) polietoxi-(6—11 szénatomos) alkil-fenil-étert, vagy (3—25 etoxi-csoportot tartalmazó) polietoxi-(8—18 szénatomos)-alkil-étert, vagy 1 -3-(3—25 etoxicsoportot tartalmazó)-polietoxicsoporttal szubsztituált cukoralkoholok 8—18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy egy epesavszármazékot és/vagy 6-10 szénatomos zsírsavak alkálifémsóit használjuk egy szinergetikus hatású olyan alkohollal kombinálva, amelyet 5-8 szénatomos egyenesláncú vagy elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholok, adott esetben 1—3 halogénatommal szubsztituált fenol, 1—2 hidroxicsoporttal szubsztituált naftalin vagy 1-4 halogénatommal szubsztituált, 1—3 szénatomos alifás alkoholok közül választhatunk ki. A találmány annak a meglepő ténynek a felismerésén alapul, hogy az említett alkoholok, amelyek önmagukban egyedül semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak a koleszterint-észterázra, bizonyos detergensek önmagukban ismert aktiváló hatását szinergikusan jelentősen erősítik, és bizonyos, önmagukban nem aktiváló detergenseknek aktiváló hatást biztosítanak. Ez azt jelenti, hogy ilyenfajta nem aktiváló, de a kereskedelemben széles körben elterjedt detergensek is használhatók. Ugyanígy, definiált molekulasúlyuk és szilárd állaguk miatt kedvező, de rossz aktiváló tulajdonságaik miatt eddig alkalmatlan ionos detergensek is használhatók. Továbbá enzim takarítható meg, növelhető a maximálisan elérhető reakciósebesség, csökkenthető a szükséges ionerősség és végül a sokféle kombinációs lehetőség folytán az észterázaktiváló rendszer hozzáilleszthető a reakcióelegy további komponensei által megkövetelt feltételekhez. A találmány keretein belül felhasználható polietoxiéterek példái a políetoxi-zsiralkohol-éterek, így polietoxí-lauri-éter és hidroxi-polietoxi-dodekán-éter, alkilfenil-éterek, így polietoxi-nonil-fenil-éter és polietoxioktil-fenil-éter, zsírsav-észterek, így polietoxi-szorbitánmonolauráí és hasonlók. Az epesav-származékok közül kólsav, dezoxi-kólsav és ezek alkálifém-sói előnyösek. A zsírsav-alkálifémsók közül különösen a nátriumsók előnyösek. A találmány keretein belül alkalmazható egyenesláncú, elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholokra példaként a pentanol, terc-amilalkohol, metil-pentanol, hexanol, ciklohexanol, oktanol és izookatanol, említhetők. Alkalmas alkohol továbbá a fenol és dihidroxinaftol. Előnyösek a halogénszubsztituált fenolok, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
