183064. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív anyagokat tartalmazó folyadákok komponenseinek szétválasztására és elemzésére
1 183 064 képességéhez viszonyítva kicsi, és ezért bár az anyagok jelenlétét érzékeli (jelet ad), de azok szeparált voltát nem (a jel folyamatos). (3. ábra). A szeparációs detektornál érzékenyebb biológiai teszt-objektum azonban - mégha a szeparációs rendszer csekély felbontó képességéből következően csak jelentéktelen mértékben szepaiálja is a minta összetevőit — a szeparáció megtörténtét diszkrét biológiai válaszokkal jelzi. (Ez történt a bemutatott konkrét kísérletben.) . A fent ismertetett esetekben a szeparációs detektor vagy „néma” marad (1. ábra profiljainak ,,C’ és „J” frakciói) vagy plátószerű jelet ad (1. ábra prcfiijainak Ji — J5 frakciói és a konkrét kísérlet); a biológiai vizsgálat során azonban különálló, diszkrét válaszokat kapunk. A találmány szerinti eljárás segítségével több vizsgált komponens esetében a biológiai hatások vonatkozásában szimultán kaphatunk felvilágosítást. Az összetevők fizikokémiai tulajdonságainak és a biológiai hatékonyságának szimultán vizsgálata és regisztrálása az eddigieknél gyorsabban és egyszerűbben végezhető el. A találmány szerinti eljárás során a szeparációs és a biológiai vizsgálatokat, valamint a detektorokat is, széles körben variálhatjuk és tetszés szerint kombinálhatjuk. Ez a variálhatóság és kombinálhatóság az eljárásnak nagy hajlékonyságot kölcsönöz. Dózis-hatás görbe felvétele Mivel a folyadékminták összetevői a szeparác ós rendszerről többé-kevésbé frakcionáltan távoznak, az egyes frakciókban foglalt anyagféleségek koncentrációja folyamatosan változik. (Pl. az eluációs görbe által repiezentált koncentráció a görbe alakjának megfelelően, először folyamatosan nő, majd csökken). Hasonlóképpen a biológiai válasz intenzitása is — a változó koncentráció függvényében — folyamatosan változik. Ilyenformán a dózishatás görbék egyidejű felvételére is mód van. Emberi és állati életfolyamatok természetes (endogén) szabályozó anyagainak jellemzése Az emberi és állati eredetű biológiai folyadékok (szervek különböző kivonatai, szérum, vizelet, likvor stb.) a sejt-szintű, fiziológiás és patológiás folyamatszabályozás természetes (endogén) molekuláris regulátorainak és mediátorainak nem egyszer kizárólagos lelőhelyei. A természetes (endogén) anyagokat tartalmazó biológiai folyadékmintákban a biológiai hatások kimutatására a találmány szerinti eljárás igen előnyös. 1 1. példa Az előzőekben elvileg és általánosságban ismertetett eljárás konkrét alkalmazását az alábbi egységekből álló rendszeren végezzük: 1) Sephadex G-25 oszlop (szeparációs rendszer); 2) a szeparált frakciók 254 nm-en mért elnyelésének folyamatos detektálását és regisztrálását lehetővé tevő rendszer (1. detektor); 3) a) tengeri malac vékonybél izolált hosszanti izomkészítmény b) izolált tengeri malac méhszarvcsík készítménye c) izolált patkányduodenum készítményből álló teszt-rendszerek (biológiai teszt-rendszer); 4) az izolált simaizomkészítmények mechanikus válaszát elektromos jellé alakító Bioforcemeter (II. detektor). E kísérletben egészséges női vizelet összetevőinek biodetekciójára és bioszeparációjára került sor. ... aj A vizelet gyűjtése Egy reproduktív korban levő, egészséges nő 24 óra alatt ürített vizeletét a bakteriális szennyeződés elkerülése érdekében 10 ml 1 mólos ecetsavat és 10 ml toluolt tartalmazó 2000 ml térfogatú üvegedényben gyűjtöttük. A vizeletet a frakcionált gyűjtés során 4 °C-on, majd a feldolgozásig —30 °C-on tároltuk. 2 b) A vizelet kivonása (extrakciója) A tárolt vizelet 264 ml-ét, 50 °C-on, vákuumban kb. tízszeresére (26 ml) betöményítettük és a keletkező csapadékot szobahőmérsékleten, 10 000 rpm.-el, 10 percen át folytatott centrifugálással eltávolítottuk. A felülúszót kétszer, egyenként 5 perces időtartamig, kétszeres térfogatú n-butanollal kizártuk. A butanolos fázisokat egyesítettük, majd 50 °C-on, vákuumban szárazra pároltuk. Az így kapott száraz maradékot az oldáshoz minimálisan szükséges térfogatú (6,6 ml) desztillált vízben oldottuk fel és felhasználásig —30 °C-on tároltuk. ej A találmány szerinti vizsgálati rendszer a) A szeparációs rendszer Sephadex G-25 (superfine) gélt Krebs-oldatban szuszpendáltunk és szobahőmérsékleten hat órán át duzzasztottunk. A duzzasztott gélt ülepítés és dekantálás után további három alkalommal mostuk háromszoros térfogatú Krebs-oldattal (Vgéi : V Krebs oldat = 1:3). Az így előkészített gélt 1,6 x 40 cm-es temperálható oszlopba töltöttük. Az ülepedő géloszlop felett kialakult holt teret megszüntettük. A géloszlop Vt (r2. . h) és V0 (5 ml . 0,2 %-os térfogatát Blue dextrán (színezett dextrán) oldattal meghatároztuk, majd szükség szerint 5 ml Krebs-oldatban oldott 250 nE (JU) oxitocint, 1X10-6 g bradikinint, IX10"6 g porsztaglandin F2 a-t, illetve esetenként 1-1,5 ml vizelet extraktumot vittünk fel az oszlopra. A 37 °C-on temperált géloszlopot ülepedés után háromszoros térfogatú (65,11 ml) ugyancsak temperált Krebs-oldattal 0,55 ml/perc sebességgel áramoltattuk át, s az eluátum optikai aktivitását 254 nm-en folyamatosan regisztráltuk (I. detektor).- Az oszlopról eluált frakció.k átlagos látszólagos megoszlási hányadosait (Kav) egyenlet alapján számítottuk, ahol Ve a hatékony frakció hatásmaximumán mért eluációs térfogat. Az egyes komponenseket a kav értékkel jellemezhetjük. ß) A biológiai vizsgálat-rendszer A géloszlopra felvitt vizeletkivonat frakcióinak biológiai hatását a Sephadex G-25 géloszloppal sorbakötött és a géloszlopról elfolyó oldattal az alábbi szerveken átáramoltatva vizsgáltuk: folyamatos átáramol tatáshoz használt edényben felfüggesztett izolált tengerimalac vékonybél hosszanti izmon, méhszarv-csíkon, valamint patkány duodenum. Az átáramoltatást 0,55 ml/perc sebességgel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
