182997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás módosított intakt erithrociták előállítására
1 182 ‘397 2 hemoglobinnak a vörös vérsejtekben az oxigénhez való affinitásától függ. Az oxigénhez való affinitást szabályozó, az eritrocitákban levő alloszterikus effektorok közül a Bohr-protonok, a széndioxid és szerves foszfátvegyületek, különösen a DPG (2,3-bisz-foszforil-glicerát, természetes alloszterikus effektor) és ATP (adenozintrifoszfát) jelentős. A tárolt vörös vérsejtek DPG-ben és ATP-ben való elszegényedése az oxigénhez való affinitás fokozatos emelkedéséhez vezet. [Balcerzak S. és tsai: Adv. Exp. Med. Bioi. 28 (1972) 433—447]. Ezt az 1. ábrán az oxigén parciális nyomás 25 °C-on mért féltelítettség mellett a tárolási idő függvényében történő grafikus ábrázolásával mutatjuk be, (az eritrocitákat 4 °C-on tároljuk). Az oxigén-megkötési izotermákat széndioxid távollétében konstans pH-értéken (pH=7,4) mérjük a fenti alloszterikus effektoroknak a féltelítettségi nyomásra való befolyásának kiküszöbölése céljából. A polifoszfátokban való időtől függő elszegényedés végpontját APo2(l/2)= 4,2 Torr érték határozza meg, azaz a teljesen poliföszfátmentes hemoglobin féltelítettségi nyomása. Akiindulási pont - azaz a friss eritrociták Po 2(l/2) értéke - a szuszpenziós közeg összetételétől függ. E polifoszfátokban való elszegényedési görbékből a tárolt eritrociták új funkcionális paramétere határozható meg, azaz a polifoszfátokban való elszegényedés ún. felezési ideje az eritrocitákban. Ez 0,1 mólos pH =7,4 értékű izotóniás bisz-trisz-pufferben 9 nap és ACD-ben (citromsav-nátriumcitrát-dextróz) 12 nap. Az eritrociták polifoszfátokban való elszegényedése az oxigén-megkötési izotermák „balra tolódását” és ezáltal az oxigénleadási képesség csökkenését okozza. A 4°C-on tárolt eritrociták esetében az oxigén-megkötési görbék „balra tolódását” és az oxigénleadási képesség csökkenését (25 °C-on mérve) a 2. ábrán tüntetjük fel. Friss eritrociták telítettségét 30 Torr oxigén parciális nyomás mellett 11%-os értékig csökkentjük, míg polifoszfátban félig elszegényedett eritrociták telítettségét csak 1%-ig csökkentjük. A polifoszfátokban elszegényedett eritrociták oxigén-megkötési görbéinek „balra tolódása” a szövetekben az oxigénleadást befolyásolja. Tárolt vér [DPG (2,3-biszfoszfoglicerát) hiányú] nagymértékű transzfúziója így az izmok pH-értékének csökkenéséhez és a plazma laktátszintjének emelkedéséhez vezet, melyet a vérnyomás „transzfúzió-szindromá”-nak nevezett csökkenése kísér. [Kevy S. V. és munkatársai: Adv. Exp. Med. Bioi. 28 (1972) 511—516], A pH-érték ezen csökkenése csak részben egyenlíti ki a 3. ábrán feltüntetett „balra tolódást”. A pH-érték 7,42-ről 7,08-ra való eltolódása 30 Torr oxigén parciális nyomás mellett a vörös vérsejtek oxigénleadását 1 %-ról 5%-ra növeli (17 napon át, 4 °C- on, 0,1 mólos pH=7,4 értékű izotóniás bisz-trisz-pufferben való tárolás esetén; azonban a friss vörös vérsejtek esetében pH=7,46 értéken megfigyelt 11%-ig történő leadás a Bohr-effektussal egyedül nem érhető el (lásd 2. ábra). A 0,1 mólos izotóniás bisz-trisz-pufferben, illetve trisz-pufferben szuszpendált vörös vérsejtek pH-értékének az oxigén-affinitásra kifejtett hatását (Bohr-effektus) a 4. ábrán 7,0 és 7,8 közötti pH-tartományra adjuk meg. Az oxigén-megkötési görbéket 25 °C-on széndioxid távollétében mérjük 17 napon át 4 °C-on tartott eritrocítákkal. E „megöregített” eritrociták a hemoglobin oxigénhez való affinitására kifejtett polifoszfát-hatásuknak több mint a felét elvesztették (lásd 1. ábra). A Bohreffektus — AP0j/i/2/ApH 0,53 proton pro mól oxigén értéknek felel meg. Amennyiben a polifoszfát-effektus legalább 75%-a elveszett, az oxigénmegkötés alatt leadott Bohr-protonok száma a vörös vérsejtek legalább 34 napos koráig állandó. Ezért a tárolás — azaz a polifoszfátokban való elszegényedés — az eritrociták Bohr-effektusát nem befolyásolja. Módszerek: Emberi vér vétele és tárolása Fiatal, egészséges önkéntes kísérleti személytől 100 ml vért veszünk, melyet 50 ml ACD (sav-citrátdextróz) stabilizátort tartalmazó 250 ml-es bio-lombikban (Biotest-Serum-Institut, Frankfurt am Main), fogunk fel. A mintát 4 °C-on tároljuk. Emberi eritrociták kinyerése és tárolása Fiatal egyéntől vett 300 ml vért műanyag zacskóban fogunk fel, mely a véralvadás megakadályozása céljából heparint vagy nátriumcitrátot tartalmaz. A vérmintát jégfürdőn lehűtjük. A további kezelést 4 °C-on végezzük el. Az eritrocitákat a plazmától 23 500 g-el 20 percen át történő centrifugálással elválasztjuk (Sorvall, Tip. RC—2B; Rotor SS 34; percenként 12 000 fordulat). A vörös vérsejteket 7,4 pH-értékű izotóniás bisz-triszpufferben szuszpendáljuk (0,1 mólos, 0,154 mól nátriumkloridot tartalmazó bisz-trisz-puffer) és centrifugáljuk. E mosási műveletet háromszor megismételjük. Ezután a leülepedett eritrocitákat 300 ml 7,4 pH-értékű izotóniás bisz-trisz-pufferben szuszpendáljuk és4°C-on tároljuk. A pH-mérése és az eritrocita szuszpenzió beállítása A 7,4 pH-jú izotóniás 0,1 mólos pufferben, illetví ACD-ben tartott vörös vérsejteket szobahőmérsékleten 7 percen át 8000 g sebességgel centrifugáljuk (Eppendorl centrifuga, 3200 típus, percenként 12 000 fordulat) Az eritrocita-szuszpenziót a puffer-közeg ismételt kiese rélésé vei a kívánt pH-értékre állítjuk be. A sejteket a ki vánt pufferben szuszpendáljuk és ismét centrifugáljuk. E műveletet a kívánt pH-érték eléréséig megismételjük. A pH-mérést 25 °C-on üvegelektróddal végezzük (Ingold, Frankfurt, 406—M3 típus, a=35 mm). A pH- mérés pontossága ±0,02 egység. Inozit-hexafoszfáttal töltött lipid-vesikulum előállítása Inozit-hexafoszfátot pl. szobahőmérséklet és 50 °C közötti hőmérsékleten izotóniás bisz-trisz-pufferben (0,10 mólos, bisz-trisz, 0,154 mól nátrium-klorid) 7,4 pH-értéken telítődésig (0,19 mól) oldunk. A kapott oldatban foszfatidil-kolin (PC), fiszfatidil-szerint (PS) és koleszterin (Ch) 8:2:7 mólarányú lipin-keverékét (lásd 1. táblázat) szuszpendáljuk és nitrogén-atmoszférában 45 percen át kb. 50°C-on ultrahang besugárzásnak vetjük alá. A vesikulum előállításának hőmérséklet-tartományának csupán a puffer fagyáspontja és a polifoszfát hőstabilitása szab határt. A kezelést ultrahang dezintegrátorral (Schöller 125 típus, Frankfurt am Main) titán merülő szondával (10 kHz) végezzük el. Az ultrahangos kezelést előnyösen 100W/cm2 feletti energiával végezzük el. A kezelés után a vesikulum szuszpenziót 1 órán át ultracentrifugában (Beckmann L5—65 típus, Rotoll 60) 25 °C-on 100 000 g-el centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő réteg a < 500 A átmérőjű kis lipid-vesikulumokat 5 10 15 20 25 3C 35 40 45 50 55 60 65 5
