182981. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz koncentrátum előállítására mosóporhoz
1 i»z yai 2 Törzs 1. táptalaj 2. táptalaj 3. táptalaj NRRL B -11301 NRRL B-11302 NRRL B — 11303 160 219 153 158 200 155 161 192 15.0 A 2.' táptalaj alkalmazásával a fenti módon kapott 5 tenyészetmintákat 30 percig centrifugáljuk. 15 000 g értéken. A felülúszót elválasztjuk és 50 ml alikvot részeket 37 °C-ra melegítünk. 15 g vízmentes nátriumszulfátot adunk az egyes alikvot részekhez, és az elegyet 30 percig keverjük. A csapadékot szűrjük, vákuumban szárítjuk. 10 Az ilyen módon kapott proteáz koncentrátumok a következő jellemzőkkel rendelkeznek : Törzs Proteolitikus aktivitás, AU/g Fehérjetartalom, Peptid-frakció, százalék százalék B-11301 11 34 8 B-11302 10 35 10 B-l 1303 10 31 8 A Bacillus licheniformis NRRL B—11301 törzs alkalmazásával nyert termékből 5 g mintát 130 g karboxi-metil-cellulózt tartalmazó, 25X23,5 cm méretű oszlopon 20 kromatografálunk a korábban már ismertetett körülmények között. A 45 ml/óra áramlási sebességnél összegyűjtött 20 ml-es frakciók OD2 s 0 -értékének ellenőrzése alapján kaptuk a kromatogrammot. Továbbá, ugyanennek a koncentrátumnak a 25 3 súly%-os oldatát agaróz gél elektroforézisnek vetjük alá a korábban ismertetett módszer alkalmazásával, összehasonlító anyagokként a szubtilizin és a C komponens 1 vegyes %-os oldatait használtuk. A kapott és a 3., illetve a 4. ábrán bemutatott kromatogram, illetve elektroferog- 30 ram azt mutatja, hogy a proteáz koncentrátumban (4. ábra, III. folt) kimutatható egyetlen proteáz a szubtilizin (II. folt), míg a C komponens (I. folt) nincs jelen a koncentrátumban. 35 2. példa Bacülus licheniformis NRRL B—11301 törzset 1—2 napig tenyésztünk 37 °C-on, agar-agar táptalajon, Fernbach lombikban. A kultúrát ezután rozsdamentes acél 40 fermentáló tartályba visszük át, amely az alábbiakban ismertetésre kerülő fermentációs közeget tartalmazza. 24 órán át tartjuk 34 °C-on levegőztetés és keverés közben. A kapott sűrű kultúrát az enzimtermelő tartály beoltására használjuk. 45 A beoltó tenyészetet (35 liter) rozsdamentes acél fermentáló tartályba továbbítjuk, amely az alábbi fermentációs közeget tartalmazza. A fermentálás körülményei, mind a beoltó tenyészetet termelő tartály, mind pedig a fő fermentáló tartály esetén a következők: 30 Teljes tanktérfogat: Táptalaj térfogata: Levegőztetés mértéke : Keverés: Hőmérséklet: A táptalaj összetétele : Burgonyakeményítő Szójababliszt Na, HP04*12H,0 BAN 120 L Pluronic-61 550 liter 350 liter 300 liter/perc 400 fordulat/perc, hatlapátos, 28 cm átmérőjű turbinakeverővei 34 °C 100 g/I 50 g/1 10g/l 0,1 ml/1 1 g/1 55 60 A táptalaj elkészítése : A táptalajt 50°C-ról 95 °C-ra melegítjük fel 50 perc alatt, majd 60 percig sterilizáljuk 121 °C-on. 65 50 órás fermentálás után a proteáz-aktivitás 160 AU/kg. A meghatározást a módosított Anson-módszerrel végezzük. A fermentlét 5 °C-ra hűtjük. a) A fenti fermentléből vett mintát 30 percig centrifugáljuk 153)00 g intenzitással. A felülúszót elkülönítjük és 37 °C-ra melegítjük. Vízmentes nátriumszulfátot adunk hozzá 320 g/1 koncentrációig, majd az elegyet 30 percig keverjük, továbbra is 37 °C-on. A csapadékot szűrjük és vákuumban szárítjuk. Az így nyert proteáz koncéntrátum jellemzői: proteolitikus aktivitás 8 AU/g fehérjetartalom 20% peptid-frakció 4% Karboxi-metil-cellulózon végzett kromatografálás és az agaróz gél elektroforézis — a vizsgálatokat az 1. példában ismertetett módon végezzük — azt mutatja, hogy a kapott proteáz C komponenst nem tartalmaz, s az egyedül kimutatható proteáz a szubtilizin. b) A fenti fermentléből vett további mintát 30 percig centrifugáljuk 15 000 g intenzitással. A felülúszót elkülönítjük, a térfogata háromszorosának megfelelő mennyiségű acetont adunk hozzá lassan, erőteljes keverés közben. A képződő csapadékot szűrjük, vákuumban szárítjuk. A kapott proteáz koncén trátum jellemzői: proteolitikus aktivitás 6 AU/g fehérjetartalom 15% peptid-frakció 3% Karboxi-metil-cellulózon végzett kromatografálás és az agaróz gél elektroforézis - a vizsgálatokat az 1. példában leírtak szerint hajtjuk végre — azt mutatja, hogy a kapott proteáz a szubtilizin. 3. példa Kereskedelmi proteázkészítményt állítunk elő az alábbiak szerint: Premixet készítünk, amely 25 s%, a 2a) példa szerinti enzim koncentrátumot (8 AU/g), 2% polivinil-pirrolidorit, 6% polietilén-glikol 6000-t, és 67% nátriumkloridot tartalmaz. Megnedvesítjük 8% vízzel, 0,9 mm lyukméretű szitán extrudáljuk, majd gömbszerű részecskékké alakítjuk az 1 362 365. sz. nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett módon. A részecskéket fluidizált ágyban szárítjuk 0,5% körüli nedvességtartalomig, 4 süly% polietilén-glikollal vonjuk be, végül titándioxid és magnéziumszilikát összesen 11% mennyiségével elporítjuk. A végső enzimkészítmény aktivitása 1,7 AU/g. 4. példa Szemcsézett proteázkészítményt állítunk elő, gyakorlatilag a 4 106 991. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módon. 25 súly%, finomra őrölt, a 2a) példa szerint készített proteáz koncentrátumot (9 AU/g), 2% titándioxidot, 1% cellulózpórt (CEPO S20, gyártó The Swedish Cellulose Powder and Wood Flour Mills, Ltd.) és 62% finomra őrölt nátriumkloridot keverünk össze Lödige keverőgépben, a fenti amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példájában leírt módon. A száraz keveréket kötőanyagként polivinil-pirrolidon K 30 4,5%-os vizes oldatával permetezzük be. A kötőanyagot a teljes keverék súlyára számított 1% mennyiség-6
