182537. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikus vér koaguláló faktor elkülönítésére polieleaktrolitokkal
182537 4 A találmány tárgya új eljárás a vér koaguláló faktor elkülönítésére polielektrolitokkal. A vér koagulációjának folyamata összetett élettani folyamat, amely az egészséges teljes vérben megtalálható több anyag kölcsönhatása révén következik be. Ismeretes, hogy bizonyos egyénekben a vér koagulációjának mechanizmusában részt vevő bizonyos faktorok hiányoznak vagy sérültek. így a klasszikus hemofiliában szenvedő betegekben az antihemofiliás A faktor (AHF, Faktor VIII) sérült. Azoknak a betegeknek a vérplazmájából, akik az úgynevezett hemofïlia B betegségben szenvednek, hiányzik a tromboplasztin-komponens (PTC, Faktor IX). A hemofiliás betegek kis százalékának véréből hiányzik az úgynevezett Von Willebrand faktor, amely a VIII faktor rokonvegyülete. Azok közül a faktorok közül, amelyek fontos szerepet játszanak a koagulációs mechanizmusban, és amelynek hiánya zavarokat okoz, megemlítjük a II, VII és X faktorokat. Az utóbbi három vegyület a IX faktorral együtt gyakran protrombin-komplex faktorokként szerepelnek az irodalomban. A vér összegyűjtését és nagymennyiségű vér és vérösszetevő gyűjtését végző modern vérbankok fejlesztésében a pontos előkészítő rendszer lényeges. A második világháború óta általában citromsav, nátriumcitrát és dextróz oldatban gyűjtik össze a vért, amelynek ismert neve ACD-vér. A vér előkészítésének és tárolásának sokkal egyszerűbb módja azonban, ha a különböző vérkomponenseket tároljuk, mivel így könnyebben eleget tudunk tenni a környezeti igényeknek, mint a teljes vér tárolása esetén. Ezenfelül a szükségesnél több vérösszetevő adagolása a betegnek pazarlásnak számít, és hátrányos is lehet. így annak a hemofiliás betegnek, aki bizonyos vérkoagulációs faktorokat igényel, optimális esetben csak ezeket a faktorokat kell adnunk, esetleg ezen faktoroknak tisztított sűrítményét. Ahogy az például a 3 682 881 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásból és más szabadalmakból és közleményekből ismeretes, a vér koagulációjában részt vevő faktorok, különösen a VIII faktor és a protrombin-komplexben részt vevő faktorok elválasztása lehetséges. Az ilyen elválasztásokkor különböző anyagokat használnak, például báriumszulfátot, alumíniumhidroxidot, polietilén-glikolí, rivanolt (6,9-diamino-2-etoxi-akridin-laktát), glicint, DEAE-cellulózt és DEAE-Sephadex gyantát. A 3 554 985 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban a vérkomponensek elválasztására vízben nem oldódó, keresztkötéseket tartalmazó polielektrolit típusú kopolimereket használnak. Ezek a vegyületek keresztkötéseket tartalmazó kopolimerjei egy 2—12 szénatomos telítetlen monomernek, és egy a következő anyagokból álló monomernek: a. egy telítetlen polikarbonsav vagy polikarbonsav-anhidrid és egy telítetlen polikarbonsav-amin-imid keveréke, és b. egy telítetlen polikarbonsav-amin-imid. A polimer egység meghatározott minimális százalékban amin-imin-csoportot tartalmaz, amely di-(rövidszénláncú)-alkil-amino-(rövidszénláncú)-alkil-imid-csoport, ahol a rövidszénláncú alkilcsoport 1—5 szénatomos. Minden polimer egységben reakcióképes helyek találhatók anhidridcsoport vagy két karboxilcsoport, vagy ezen csoportok származékai3 nak alakjában. A vegyületekben ezen reaktív helyek legalább 3%-át di-(rövidszénláncú)-alkil-amino-(rövidszénláncú)-alkil-imiddé alakítják. A 3 555 001 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban polielektrolit kopolimereket ismertetnek a különböző vérkomponensek, mint például az albumin, gamma-globulin, lipoproteinek, hemoglobin és az anti-tripszin faktor elkülönítésére. Ezen összetevők elválasztásakor a töltéssel rendelkező protein egy töltéssel rendelkező oldhatatlan anyag felületére adszorbeálódik elektrosztatikus kölcsönhatások révén, amelyek az ellentétes töltésű helyek között jönnek létre, és amely kapcsolatos a protein izoelektromos pH-jával (IEpH) és a reakcióelegy pH-jával. Ha a koagulációs faktorokat, például a VIII faktort bizonyos, a 3555 001 és a 3554 985 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban ismertetett polielektrolitokkal frakcináljuk, ezek az elkülönített vérösszetevők az ismert módon kivitelezett véralvadási vizsgálatok szerint jelentősen csökkentik a véralvadás idejét. Az elkülönített VIII faktornak ez az előzetes aktiválása jelentősen korlátozza a termék klinikai használhatóságát. Ilyen előzetes aktivációt figyeltek meg kutyákban is, ha az elkülönített VIII faktort intravénás injekcióval adagolták az állatoknak. A reakciók a következők voltak: 1. változás a viselkedésben, ugyanis a kutya 24 órán át keringett a ketrecében; 2. hemoglobinuriára utaló hemolízises reakció és 3. jelentős csökkenés a vérlemezek számában vérnyomásnövekedéssel együtt. Ez az előzetes aktiváció összefüggésben van az adszorbeáló polielektrolit szerkezetével és összetételével, ugyanis benne hidrogénkötést kialakító hidroxilcsoportok vannak. A polielektrolit kopolimer például az A általános képletben bemutatott polimer szerkezeti egységeket tartalmazhatja. Az A képletben az I csoport a funkcionális amin-imid-csoport; a II csoport a védő hidroxi-alkil-imid-csoport; míg a Ill-mal jelölt csoport a keresztkötéseket hozza létre. j\z általános képletben R 1-5 s'én atomos alkilcsoport, Z pedig kétértékű, 2-18 szénatomos szénhidrogén csoportot jelent. A 3 555 001 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás szerint a polielektrolit 2-100% amid-imid-kötést tartalmazhat, a többi karboxilcsoport anhidrid-alakban van jelen. Ugyancsak ebben a leírásban olvassuk, hogy a többi, nem módosított polimer anhidrid-egységet neutrális csoportokká vagy egységekké alakíthatjuk át oly módon, hogy a nem reagált anhidrid-egy ségeket például alkü-aminokkal, amino-alkoholokkal vagy alkoholokkal reagáltatjuk. Az A képletben a szabadon maradt karboxilcsoportokat, amelyek anhidrid-alakban léteznek, neutrális csoportokként mutatjuk be, ezeket a II-vel jelzett helyen amino-alkohollal reagáltattuk, ily módon hidroxil-alkil-imid-egységek alakultak ki. Annak ellenére, hogy a II helyen az anhidridcsoportokat amino-alkohollal blokkolták, a polimer vázba ily módon bevezetett szabad hidroxilcsoportok (hidroxil-alkil-imid-csoport alakban) hozzájárulnak a VIII faktor előzőekben említett előzetes akti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
