182530. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpesvírus vakcina előállítására
7 182530 8 3. példa Pulykaherpesz-vírusok (ATCC VR-584 törzs) 132 hengerpohárban végzett tenyésztése után a vírusokat a szokásos módon összegyűjtjük. A kapott folyadékot kúpos centrifugaedényekbe töltjük, és 10 percig centrifugáljuk 3-5 X-on percenként ezer fordulattal. A centrifugaedényben elhelyezkedő felső folyadékréteghez mintegy 30 ml szabályozott pH-jú puffer stabilizátort (90 ml SPGA 10 ml 1 mólos káliumfoszfát pufferrel összekeverve, pH = 7,8) adunk. Valamennyi centrifugaedény tartalmát így dolgozzuk fel. A kapott vakcina végső térfogata 700 ml. Az elméleti sejtkoncentráció mintegy 15,1-szer 106 sejt/ /ml. A 700 ml térfogatú szuszpenziót jeges fürdőbe merítjük, és ultrahanggal sugározzuk be egy Flow Sonicating készülék segítségével. Az ultrahangos kezelés után a vakcinát fémedénybe töltjük és alkoholos fagyasztóanyaggal héjfagyasztásnak vetjük alá. Ezután —70 °C-on tároljuk. Egy hét múlva az edény tartalmát felengedni hagyjuk oly módon, hogy azt 29 °C-os vízfürdőn tartjuk. Ezután elvégezzük a végső hígítást és 3 ml-es ampullákba töltjük az anyagot oly módon, hogy minden ampullába 1,1 ml töltet jusson. Az ampullákat -70°C-on fagyasztjuk mintegy 6 órán át, azután liofllizáljuk, majd leforrasztjuk és felcímkézzük. 4. példa Pulykaherpeszvírus-vakcinát készítünk ATCC VR—584 törzzsel oly módon, hogy a vírust csirkeembrió-fibroblaszton tenyésztjük 4 napig 38,5 °C hőmérsékleten egy 5% steril boqúmagzat-szérumot tartalmazó 199—F10 (Gibco) tápközegben, hengerpohárban. A kapott tenyészetet a szokásos módon dolgozzuk fel. A kinyert folyadékot két kúpos centrifugaedénybe töltjük, azután 10 percig centrifugáljuk 3—5 °C-on percenként ezer fordulattal. Az egyik centrifugaedényben levő felső folyadékréteghez — annak a centrifugaedényből való eltávolítása után — 20,4 ml szabályozott pH-jú puffer stabilizátort (90 ml SPGA 10 ml 1 mólos foszfátpufferrel összekeverve, pH = 7,8) adunk, amikor is 20 x 106 sejt/ml elméleti sejtkoncentrációjú vakcinát kapunk. A másik centrifugaedényből kivett felső folyadékfázishoz egy másik szabályozott pH-jú puffer stabilizátort (90 ml SPGA 10 ml 1 mólos foszfátpufferrel összekeverve, pH = 6,2) adunk az előbbihez hasonló módon. A két edény tartalmát 30 ml-es ampullákba osztjuk szét és ezeket külön-külön kétperces, mintegy 35 Wattos ultrahang-besugárzással kezeljük 3-5 °C-on. Az ultrahangos kezelés után mindegyik mintát 3 ml-es ampullákba töltjük úgy, hogy minden ampullába 1,1 ml jusson. Ezután a készítményt -70°C-on fagyasztjuk mintegy 6 órán át. Ezután az ampullákat liofllizáljuk, majd leforrasztjuk és felcímkézzük. A liofilizált por stabilitását oly módon vizsgáljuk, hogy a készítményt 3 napig tároljuk 37 °C-on, majd 200 ml desztillált vizzel helyreállítjuk a vakcinát. A titrálási vizsgálatok szerint mindegyik ampulla 1000 dózishoz elegendő vírust, vagyis legalább 1 500 000 plakk-képző anyagot tartalmaz. Eredményeinket a 3. táblázatban közöljük. 3. táblázat A pH stabilizátor hatása a liofilizált pulykaherpeszvírus-vakcina tárolási stabilitására A puffer pH-ja Titer PFU/dózis Átlagtiter PFU/dózis 1. kísérlet 2. kísérlet 6,2 2110 2300 2205 7,8 7360 12 310 9835 Amint a példákból kitűnik, a szabályozott pH-jú puffer stabilizátorral készített vakcinák stabilitása lényegesen nagyobb a desztillált vízzel való helyreállítás után, mint a hagyományos stabilizáló hígítószerrel készített vakcináké. A példákban bemutatott eljárásban SPGA-t használtunk, egy olyan stabilizátort, amely már tartalmaz foszfátot. így például 200 ml SPGA készítéséhez 14,92 g szacharózt, 0,10 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,32 g, dikálium-hidrogén-foszfátot 0,01 g nátrium-glutamátot és 2,0 g albumint használunk fel. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárással előállítható új termék egy ampullára jutó szárazanyaga, amelyet 200 ml vízzel kell hígítani, 73,9 mg szacharózt, 3,4 mg kálium-dihidrogén-foszfátot, 16,6 mg dikálium-hidrogén-foszfátot, 0,9 mg nátrium-glutamátot és 9,9 mg albumint tartalmaz. Számításunk szerint a liofilizáláshoz bármilyen stabilizátort használhatunk, ha az lehetővé teszi, hogy a kész vakcinában ampullánként előnyösen mintegy 20 mg legyen a foszfátpuffer összmennyisége. Az eljáráshoz felhasználandó anyagok mennyiségét természetesen esetenként külön-külön ki kell számítani a fentiek alapján. Megállapítottuk továbbá, hogy eredményesen használható vakcinát kapunk, ha a számítást oly módon végezzük, hogy a kapott kész vakcinában ampullánként mintegy 10—60 mg legyen a foszfátpuffer összmennyisége. A találmány szerinti eljárással előállított kompozíció literenként mintegy 33-135 súlyrész szacharózt, mintegy 1,5-15 súlyrész kálium-dihidrogén-foszfátot, mintegy 7-30 súlyrész dikálium-hidrogén-foszfátot, mintegy 0,4—0,17 súlyrész mononátrium-glutamátot és mintegy 4,5-18 súlyrész albumint tartalmaz. Ezen a tartományon belül a dikálium-hidrogén-foszfát és a kálium•dihidrogén-foszfát egymáshoz viszonyított aránya 10 és 2 között kell legyen, az arány értéke előnyösen 5. A most említett adatok alapján bármilyen más szokásosan használt stabilizálószer mennyiségét be lehet állítani úgy, hogy azt a találmány szerinti eljárásban használva olyan stabilizált vakcinát állíthassunk elő, amely használat előtt egyszerűen desztillált vízzel hígítható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
