182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
Il 182500 12 kubálunk, így leukoforézist előidézve. 5000—40 000 egység/ml értékű interferon-titereket kapunk. A tisztítási eljárás az 1. példában leírtakkal egyezik és az alábbi lépésekből áll: szelektív kicsapás 0,5 mól ecetsavval Triton X—100 jelenlétében, 5 Sephadex G—100 oszlopon 4 mól karbamid-oldattal végzett gélszűrés, három HPLC-lépés, mégpedig pH 7,5 mellett Lichrosorb RP—8, majd Lichrosorb—Diói, és pH 4 mellett Lichrosorb RP—8 oszlopokon. 10 A Lichrosorb—Diol-oszlopnál az a-, ß-, illetve y-csúcskoncentrációknak megfelelő frakciókat öszszegyűjtjük, majd további lépésekben külön-kiilön tovább tisztítjuk. Az a-csúcsnak megfelelő 43—46. frakciókból az 15 n-propanolt azonos mennyiségű hexánnal kétszer végzett extrakcióval eltávolítjuk. A hexán-nyomokat nitrogénáramban eltávolítjuk. Az oldathoz anynyi piridint és hangyasavat adunk, hogy azok végső koncentrációja 1 mól, illetve 2 mól legyen. Az 20 oldatot 4,0 pH-jú, 1 mól piridint és 2 mól hangyasavat tartalmazó pufferrel egyensúlyba hozott Lichrosorb RP—8 oszlopra (10 u, ; 4,6x250 mm) visszük, majd 3 óra alatt 1 mól piridinformiátpufferból és n-propanolból előállított, 20 tf%-tól 25 40 tf%-ra lineárisan növekvő gradienssel eluáljuk 0,2 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 0,6 ml-es 3. táblázat: Humán leukocita-interferon tisztítása (2. példa) Egység (talált) xlO-6 frakciókat gyűjtve. Az interferon-aktivitás a 31— 35 tf% n-propanol mellett eluált frakciókban van. Ezeket a frakciókat egyesítjük és azonos leltételek mellett újból kromatografáljuk. Az interferon-aktivitást két koncentrációcsúcsban (a! és a2) 31—32 tf% n-propanol mellett eluáljuk. Kis mennyiségű komponensek 34 tf% n-propanol mellett mutatkoznak. A Lichrosorb—Diol-oszlop (3-csúcskoncentrációjának megfelelő 47—50. frakciókat egyesítjük és az a-csúcs esetén leírtak szerint dolgozzuk fel. Az interferon-aktivitás két főcsúcsban jelenik meg: ß, 32 tf% n-propanol és ß3 34 tf% n-propanol-tartalom mellett. A kromatográfia megismétlése itt nem szükséges. Egyes preparátumokban 31 tf% n-propanol-tartalom mellett ß, frakció figyelhető meg. A Lichrosorb—Diol-oszlop y-csúcsának megfelelő 52—54. frakciókat egyesítjük és a fentiek szerint feldolgozzuk. Az interferon-aktivitás 5 főcsúcsban jelenik meg: y, 31 tf% n-propanol, y2 32 tf% n-propanol, y3 34 tf% n-propanol, y.4 35 tf% n-propanol és yj 35,5 tf% n-propanol mellett. A kromatografálás megismétlése nem szükséges. Az egyes interferon-fajták előállításával kapcsolatos tisztítás eredményeit a 3. táblázatban foglaljuk össze. Protein (talált) (mg) Fajlagos aktivitás** (egység/mg) Tisztasági fok Hozam (%) 1. Inkubációs közeg 800 20 X 103 4 X101 1 100 2. 4 pH-jú felülúszó rész 800 4 XlO3 2X I05 5 100 3. Triklórecetsavas (1,5%) csapadék 780 2 XlO3 3,9 X 106 9,8 97 4. Triton X—100-as felülúszó rész 760 510 1,5 X 106 37,5 95 5. Triklórecetsavas (4%) csapadék 810 350 2,3 X 106 57,5 100 6. Sephadex G—100 660 130 5,1 XlO6 128 82 7. Lichrosorb RP—8 (pH 7,5) (2 tétel) 510 26 2 XlO7 500 64 8. Lichrosorb-Diol a-csúcs 149 5 3X 107 750 g-csúcs 148 3 5 XlO7 1 250 y-csúcs 139 1,7 8 X 107 2 000 összesen 436 54 9. Lichrosorb RP—8 (pH 4.0) a, (kétszer kromatografálva). 9 35X IO“3 2,6 X 108 6 500 a„ (kétszer kroma togra fáivá) ^ 26 65 X10~3 4,0x 108 10 000 ß* 30 75 X10~3 4,0 X 10s 10 000 ß, 13 32X10~3 4,0 X 108 10 000 Yi 15 58 XlO'3 2,6 X 108 6 500 T. 31 77 XlO'3 4 XlO8 10 000 Y. 26 74X IO'3 3,5 XlO8 8 750 Y* 3,5 10xio-3 3,5 x 108 8 750 Y» 4,5 50X IO'3 0,9 X 108 2 250 összesen 158 20 ++ fajlagos aktivitás MDBK-sejteken Az aa és ßa fajták a Lichrosorb—Diol-oszlopnál figyelt eluálási jellegzetességük alapján is különböznek egymástól: a2 68 tf%-os n-propanollal, ß3 66,5 tf%-os n-propanollal eluálódik. Az interferon-fajták 1,5x10* egységet tartalmazó mintáit nátriumdodecil-szulfáttal és 2-merkapto-etanollal inkubálva géllemezre visszük. Az elektroforézis után az a1; a2, ß2, y, és y4 csúcsok egyegy sávot adnak, míg a ß3, y3 és ßs csúcsok esetében 65 két-két sáv jelenik meg. A látszólagos mólsúlyok 7
