182462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására
» 182 462 6 W. Müller, Analytical Biochemistry 67 (1975) 372—383. lapok] és a bázisspecifikus komplexképzőkként fenil-, neütrálvörös-származékokkal kombinált hidroxi-apatit alkalmazása a kettősszálú DNA-fajták szétválasztására [W. Fakroppa és W. Müller, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71 (3) (1974). 699—703. lapok] példái jól igazolták. Az utóbb említett módszerek felbontóképessége egybevethető a pneparatív cézium-kloridsűrűséggrádienses módszerével, azaz eltérő (G+C)-tartalmú DNA-frakciók (ahol a G gaunint, C pedig citozint jelent) egymástól elválaszthatók. Az eljárásnak azonban nagy kapacitása ellenére is hátránya, hogy a 20X106-t meghaladó közepes molekulasúlyú komponensekből álló DNA-elegyek már nem kezelhetők jól, továbbá, hogy az ad'szorbensként alkalmazott különleges hidroxi-apatitot az alkalmazónak magának kell előállítania. Már hosszabb ideje ismert, hogy a nukleinsavelegyek poli(etilén-glikol)-dextrán-rendszerben, meghatározott körülmények között egyrészt RNA-ra és egyszeres láncú DNÁ-ra, másrészt kettősláneú DNA-ra választhatók szét. Eközben a kettősláncú DNA állandóan feldúsul a (könynyebb poli(etilén-glikol)-fázisban, azaz másként szólva, megoszlási hányadosa nagyobb az egyláncú nukleinsavakénál. Jóllehet a megoszlási hányadosok abszolút értékei kálium- és lítiumsók hozzáadásával kereken 3—4 nagyságrenddel változtathatók, a bázisösszetételek szerinti frakcionálás azonban ezekben a rendszerekben mégsem sikerül. A találmány kidolgozása ' során magunk elé tűzött feladat tehát abban állott, hogy eljárást dolgozzunk ki nukleinsavak, különösen egyláncú és/vagy kettősláncú és/vagy szuperhelikális és/vagy lineáris nukleinsavak elegyei, különösen DNA-elegyek bázisspecifikus és/vagy szerkezetspecifikus. nagy kapacitású szétválasztására. ‘ Kutatásaink során azt táláltuk, hogy. a fentiekben megjelölt feladat olyan polimer hordozóanyag alkalmazásával oldható meg, amelyhez nukleinsavak számára bázis- és/vagy szerkezetspecifikus komplexképző kapcsolódik közvetlenül vagy térbeli távolságót létesítő csoporton keresztül. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy ar szétválasztandó keveréket kromatografáló oszlopra visszük, amelyben olyan poli[bisz(akrilamid)] a hordozóanyag, amelyhez nukleinsavak számára komplexképző — így malachitzöld, ,fenil-neutrálvörös vagy 3-klór-7-metoxi-akridin — kapcsolódik, közvetlenül vagy térbeli távolságot létesítő csoporton keresztül, majd a megkötött nukleinsavakat eluálószerrel — így vizes só- vagy puffer-oldattal' — eluáljuk. A találmány szerinti eljárás során komplexképzőként" előnyösen a 35 képletű fenil-neutrálvöröset és a 36 képiétű malachitzöldet alkalmazunk. E színezékek önmagukban ismertek és a " kereskedelemben kaphatók vagy a szakirodalomban ismerteti módszerekkel szakember álfa! könnyen élőállíthatók.' " tí:‘ ’ ' A komplexképzőkét, illetve színezékgyököket szakember számára ismert vagy kézenfekvő módszerekkel kapcsolhatjuk kovalensen a hordozóanyaghoz, például a hordozóanyagon jelenlévő hidroxilcsoportoknak a színezékmolekulába . bevitt karboxilcsoportok útján végrehajtott észterezésével, amidképzés útján, uretánképzéssel vagy kopolimerizációval, más kopolimerizálható monomerek távollétében, vagy előnyösen ilyenek jelenlétében, a színezékmolekulába bevitt, kopolimerizálható kettőskötések révén végrehajtott kopolimerizációval, például akril-amidcsoport segítségével, amint az a találmány szerinti komplexképzők között előnyösnek ítélt, 37 ill. 38 képletű akril-fenil-neutrálvörös és akrilmalachizöld esetében látható. Az említett nevek a színezékek köznapi, triviális nevei, a vegyüle_ tek pontos kémiai elnevezése akriloil-amino-fenil-neutrálvörös illetve akriloil- amino-malachitzöld. E komplexképzőket a szakember önmagában ismert módon, az akrilmaradéknak a színezékmolekulába történő bevitelével állíthatja elő. A fenti és a továbbiakban említett esetekben az akrilgyök (illetve maradék) kifejezése azonos jelentésű az akriloilgyök (vagy-maradék) kifejezéssel. E vegyületeket a legelőnyösebben a 3. és 4 példában ismertetett eljárások szerint állítjuk elő. Az akriloil-színezékek új vegyületek. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott polimer hordozóanyag a poli-bisz(akril-amid) kispórusú, kevéssé komprimálható. Ezek a polimerek úgy állíthatók elő, hogy bisz(akril-amid)ot; például N, N’-metilén-bisz(akril-amid)-ot polimerizálunk. Megállapítottuk, hogy az említett polimer hordozóanyagok a nagy viszkozitású nukliensavoldatok affinitáskromatográfiájához igen előnyösek. Emellett az említett polimer hordozóanyagok és a polimer hordozóanyagokhoz közvetlenül vagy polimer spacerék közvetítésével kötött, a nukleinsavakkal szemben komplexképzők között nem lépnek fel erős kölcsönhatások. Kutatásaink során előnyösnek találtuk a nukleinsavak szétválasztásánál olyan adszorbens alkalmazását, ahol a polimer hordozóanyag, valamint a komplexképző között hosszabb spacer, azaz funkciós csoport nélküli hosszabb molekulalánc helyezkedik el, minthogy ez, esetben a komplexképző és a helikális nukleinsav közötti komplexképződést egy esetleges térbeli gátlás hátrányosan nem befolyásolja. . A találmány szerinti eljárás egyik különösen előnyös foganatosítási módjánál ezért olyan adszorbenst alkalmazunk, amelynél a komplexképző olyan kopolimeren keresztül kapcsolódik a polimer hordozóanyaghoz, amelynek polimerizációfoka előnyösen 200 és 300 között van. E kopolimér kialakítása céljából előnyösen olyan további monomért alkalmazunk, amely a komplexképzőbe polimeiizádó végett; bevitt és a polimer hordozóanyagon jelenlevő kopolimerizálható csoportokkal kopolimerizálható^ Ilyén további monomerként előnyösen akrilamidot alkalmazunk' és az említett, akrilcsopor. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
