182449. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 3,4,5-trihidroxi-piperidin-származékok előállítására
19 182449 20 rülmények között 1 uniói szacharózt hasít percenként, és ezzel 1 unió] glükóz felszabadulásához, amit a tesztben meghatározunk, és 1 p.mól fruktóz felszabadulásához, amit a tesztben nem mérünk, vezet. Az intesztinális diszacharidáz-kcmplexet sertés vékonybél mukózából nyerjük tripszinnel végzett emésztéssel, 66%-os etanolból —20 °C-on történő kicsapással, a csapadék 7,0 pH-jú, 100 mmólof foszfát-pufferrel történő felvevésével, majd ugyan ezen pufferrel szemben végzett dialízissel. 10 p.1 próbaoldatot, amelyet úgy állítottunk öszsze, hogy a teszt-keverék extinkciója legalább 10%kal, azonban nem több mint 25%-kal legyen e, 100%-os érték alatt, összekeverünk 100 p.1 0,1 mólos, 6,25 pH-jú maleinát-pufferrel készített intesz tinális diszacharidár-komplex oldattal, és 10 percig 37 °C-on előinkubáljuk. A diszacharidáz-komplex oldat aktivitását 0,1 SE/ml-re állítottuk be. Az előinkubálás után a szacharolitikus reakciót 0,4 mólos (0,1 mólos, 6,25 pH-jú maleinát-pufferrel készített) szacharózoldat („SÉRV A 3579”) hoz záadásával indítjuk el, és 37 °C-on 20 percig tartó inkubációs idő után 1 ml glükóz-dehidrogenázreagens hozzáadásával állítjuk le. (A reagens úgy készül, hogy 1 palack liofilezett glükóz-dehidroge - náz-mutarotáz keveréket („MERCK 14053”) és és 331,7 mg ß-nikotinamid-adenin-dinukleotidot (szabad sav, „BOEHRINGER”, tisztasági fok : I/ 250 ml 0,5 mólos, 7,6 pH-jú tris-pufferben oldunk.) A glükóz kimutatására a keveréket 37 °C-on 30 percig inkubáljuk, és ezt követően 340 mm-nél tiszta reagenssel szemben (enzimmel, azonban szacharóz nélkül) fotometráljuk. Az inhibitorok gátló aktivitásának kiszámítását az nehezíti, hogy már a teszt rendszerben bekövetkező csekély mértékű változások is, például egy kis mértékben meghatározásról meghatározásra 5 változó 100% érték, már el nem hanyagolható befolyást gyakorolnak a teszt eredményére. Ezeket a nehézségeket úgy lehet leküzdeni, ha minden egyes meghatározással egyidejűleg egy standardot is lefuttatunk; standardként egy C25H4301SN 10 képletű szacharáz inhibitor szolgál, amely 77 700 SIE/g fajlagos gátló aktivitással rendelkezik, és amelyet ha a tesztben 10—20 ng mennyiségben alkalmazunk akkor a fentiekben meghatározott nagyságrendű gátlásokat kapjuk. A 100%-os ér- 15 ték és a standard mértékben gátolt bemérés 340 nm-en mért extinciói különbségének ismeretében a 100%-os érték és a próbaoldattal gátolt bemérés extinkciókülönbségéből az alkalmazott inhibitor ' mennyiségének iigy elembevét elével ismert módon 20 ki lehet számítani annak szacharáz inhibitor egység/g (SIE/g) dimenzióban kifejezett fajlagos gátló aktivitását. A fenti in vitro tesztben meghatározott fajlagos szacharáz inhibitor aktivitásértékek a következők : 25 1-dezoxinojirimicin 465 000 SIE/g N-metil-l-dezoxinojirimicin 2 330 000 SIE/g A találmány szerinti eljárást a továbbiakban kiviteli példákkal szemléltetjük. Táplálékuktól megfosztott patkányok (6 darab) 30 vércukor-koncentrációját ^mg/dl+SD) fiziológiás konyhasóoldat (Kontroll, NaCl), 1 g főzött búzakeményítő (Kontroll, keményítő), illetve a hatóanyagot is tartalmazó keményítő orális adagolása után meghatározott időközökben Adagolás kg per os 15 perc 30 perc 45 perc 60 perc Kontroll, NaCl+ 55+ 5,2 57+ 4,5 69+ 4,9 66+ 6,5 Kontroll, keményítő 127+ 5,2 85+17 95 + 11 85 + 13 2 mg+ keményítőben 123 + 13 100 + 19 86 + 12 87 + 10 4 mg+ keményítőben 110+10 85+11 94+ 7,2 89+15 8 mg+ keményítőben 88+18 89+22 90+ 9,9 82 + 14 Adagolás kg per os . 10 pere 20 perc 30 perc 45 pere Kontroll, NaCl++ 64+ 8,4 53+ 3,9 66+ 8,2 53+ 3,8 Kontroll, keményítő 108+ 7,7 110 + 24 90 + 18 61+ 6,3 1 mg++ keményítőben 66+ 9,5 68+ 7,8 80+ 6,9 87 + 13 2 mg++ keményítőben 65+ 5,8 61+ 6,7 64+ 5,9 63+ 5,8 4 mg++ keményítőben 60+ 1,6 59+ 2,9 62+ 3,1 58+ 3,3 Kontroll, Nad+++ 55+ 4,1 52+3,7 58+ 5,6 58+ 4,1 Kontroll, keményítő 108+18 115+ 4,9 104+ 5,6 88+ 5,6 0,2 mg+++ keményítőben 94+ 8/6 87+ 9,3 107+ 7,2 101+ 6,1 0,4 mg+++ keményítőben 86+ 6,8 77+ 7,2 90 + 10 73 + 12 0,8 mg+++ keményítőben 72+ 6,4 66+ 4,1 74 + 10 72+ 2,6 P<0,05 —P <0,01 -P <0,001 a kontrolihoz képest, keményítő + Dezoxinojirimicin ++ N-Metil-dezoxinojirimicin +++ N-Hidroxi-etil-dezoxinojirimicin P=hibahatár 10
