182442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunoglobulinok meghatározására
3 182 442 4 A találmány tárgya eljárás antigén-specifikus immunoglobulin kimutatására és/vagy meghatározására, egy új reagens valamint reagens-csomagok, amelyek fenti meghatározásokhoz használhatóak. Az immunoglobulineket öt osztályba sorolják: G, A, M, D és E. Az ezekbe az osztályokba tartozó immunoglobulineket IgG, IgA, IgM, IgD, illetve IgE rövidítésekkel jelölik. A következőkben bizonyos immunoglobuliniket IgX-szel fogjuk jelölni, ahol X jelentése A, M, D és E. Az immunoglobulinek szerkezetileg hasonlóak, és legalább két nehéz láncot (H-lánook) és két könnyű láncot (L-láncok) tartalmaznak, amelyek diszulfid hidakkal és néha addíciós polipeptideken át kölcsönösen kapcsolódnak egymáshoz. Valamennyi nehéz és könnyű lánc egy változtatható és egy állandó részt tartalmaz. Néhány immunoglobulin a két nehéz és két könnyű lánc összetett bázikus szerkezetéből épül fel. Az antitestek immunogbulinek, amelyek az antigéneket specifikusan megkötik. Az antitest specifikussága a 4 peptid-lánc változtatható részéhez rendelhető, amely mind a molekula ugyanazon oldalán helyezkedik el (N-terminális oldal). Bizonyos antitestek számos biológiai hatása az érintett immunoglobulin molekula láncainak nem változó részein keresztül érvényesül. Az antitesteket felhasíthatjuk olyan fragmensekre, amelyek még rendelkeznek az antigén specifikusságával, valamint olyan kristályosítható fragmensekre, amelyek ezen antigénmegkötő tulajdonsággal már nem rendelkeznek. Antigénmegkötő fragmens például a Fab-fragmens, Fab’-fragmens és F(ab’)2-fragmens, Antigénspecifikusisággal nem rendelkező, kristályosítható fragmens például az Fc-fragmens és Fc’-fragmens. Normál emberi szérumban levő különböző immunoglobulinek koncentrációi a következők: IgG 8 — 16 mg/ml, lg A 1,4 — 4 mg/ml, IgM 0,5 — 2,0 mg/ml, IgD 0,0 — 0,4 mg/ml és IgE 0,000017 — 0,000450 mg/ml. Mennyiségileg ezért az IgG osztály antitestjei az antitesteknek a legfontosabb csoportját alkotják. Az IgM osztály antitestjei a fertőzés korai fázisában jelennek meg, így az IgM osztály antitestjeinek meghatározása a fertőzéses megbetegedések korai kimutatásában nagyon fontos szerepet játszik. Az IgA, IgD és IgE osztályok antitestjei a szérumban bizonyos patológiás állapot esetén magasabb koncentrációkban lehetnek jelen. Például az IgE osztály antitestjei megnövekedett koncentrációban vannak jelen allergiás megbetegedések esetében és az IgD osztály antitestjei közreműködnek az auto-immun megbetegedéseknél. Antigénspecifikus immunoglobulinok sajátos osztályának a meghatározása különleges klinikai jelentőséggel bír. Az antigénspecifikus immunoglobulinek meghatározhatók iimmunokémiai módszerekkel, ahol valamely immuno-komponensnek a kimutatni és/vagy meghatározni kívánt antitesthez mutatott kötődési affinitását hasznosítják. Az ismert eljárások szerint a meghatározandó antitesthez kötődési affinitással rendelkező immuno-komponenst egy szilárd hordozóra történő kapcsolással oldhatatlanná teszik, és a másik specifikus kötődésű anyagot például fluorescens-, kromofor- vagy radioaktív csoporttal vagy enzimmel jelzik. Ezeknek a módszereknek az a hátránya, hogy amikor reumatoid faktor (RF) van jelen, amely gyakori a szérumban, akkor hamis pozitív 'reakciót adnak. Továbbá különböző osztályú immunoglobulinek és különösen különböző osztályú antigénspecifikus immunoglobulinek elválasztási módszerei munka- és időigényes műveletek és általában csak kvalitatív vagy szemi-kvantitatív eredményeket adnak. Ilyen módszerek például az immundiffúzió, immuno-elektroforézis és sűrűség-gradiens elvén végzett centrifugálás. A reumatoid faktor — amely gyakran ad hamis eredményeket — maga is egy immunoglobulin, amely többnyire az IgM osztályhoz tartozik. A reumatoid faktor (RF) affinitással rendelkezik az IgG osztályhoz tartozó antitestre. Az RF és IgG molekula nehéz láncainak a nem változó részén át kötődik, főleg azon a részén, amely az antigénkötő fragmensektől az antitest hasadásakor elkülönül. Mivel a reumatoid faktor rendszerint IgM osztályhoz tartozik, am 1 i-IgM immunoglobulinekkel azt szintén megkötik. A találmány az IgX osztály valamely antigénspecifikus immunoglobulinjének meghatározási módszerére vonatkozik, amelyben a reumatóid faktor zavaró hatása elkerülhető. A találmány szerinti eljárásban a szérumot — amelyben az IgX osztály antigénspecifikus immunoglobulinjét kívánjuk kimutatni és/vagy meghatározni — kapcsolatba hozzuk az érintett antigénspecifikus IgX elleni inszolubilizált antitesttel vagy ennek az anti-IgX-nek az inszolubizált antigénmegkötő fragmensévél. Ezután inkubáljuk egy olyan antigénnel, amelyre az immunoglobulinnek specifikus affinitása van, majd tovább inkubáljuk a fentiekben említett antigén elleni antitestek jelzett antigénmegkötő fragmensével. Az antitest fragmentációja — kristályosítható és antigénmegkötő fragmensre vagy fragmensekre — a nehéz láncok enzimatikus hasításával, vagy ezeknek a láncoknak enzimatikus hasításával és a nyert antigénmegkötő fragmenseknek két kisebb antigénmegkötő fragmensre történő utólagos kémiai hasításával végezhető cl. Például a papainnal végzett enzimatikus hasítással két egyforma monovalens antigénmegkötő Fab-fragmenst és antigénmegkötő tulajdonsággal nem rendelkező, kristályosítható Fcfragmenst kaptunk. A pepszinnel végzett enzimatikus hasítás révén egy bivalens antigénmegkötő F(ab’)2-fragmenst kaptunk, amely kémiailag két Fab’-fragmensre hasítható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
