182276. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makromolekulárissá alakított adenin-származékok előállítására
5 182276 4. példa Nikotinsavamid-8-(3'-polietilén-imino-3'-oxo-propiltio)-adenin-dinukleotid 1 általános képletű vegyület, ahol n=2, —-N=a polietilén iminből levezethető csoport, és B a NAD*-ból levezethető csoport. 0,76 ml, tömény sósavval S-ös pH-értékűre beállított, 33 vegyes %-os vizes polietilén-imin-oldathoz hozzáadjuk 39 mg nikotinsavamid-8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinukleotid (II általános képletű vegyület, ahol n=2, és B a NAD* -ból levezethető csoport) 0,5 ml vízzel készült oldatát, és 40 mg N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 0,5 ml vízzel készült oldatát. (A polietilénimin Worthington cég gyártmánya, Hs.: 40 000 60 000). 2 mólos sósavoldat hozzáadásával 4,8-re állítjuk be az oldat pH-ját, majd 48 órán át oly módon keverjük szobahőmérsékleten, hogy az első három óra alatt az oldat pH-ját 0,1 mólos sósavoldat esetenkénti hozzáadásával a 4,8-as értéken tartjuk. Utána vízzel 20 ml térfogatra hígítjuk a reakcióelegyet, centrifugáló csőbe töltjük át, 20 ml 1 mólos foszfát pufferoldattal 6-os pH-értéknél kicsapjuk a terméket, és 10 percen át 39 000 g-vel centrifugáljuk. A polimer csapadék fölött lévő oldatot dekantálással távolítjuk el. További tisztítása céljából 4 ml 2 mólos nátrium-klorid-oldatban és 0,05 mólos, 5,5-es pH-jú acetát pufferoldatban oldjuk a polimert, 16 ml vízzel kiegészítjük a nyert oldatot, újra 20 ml 1 mólos foszfát puíferoldattal 6-os pH-érték mellett kicsapjuk a terméket, 10 percen át 39 000 g-vel centrifugáljuk, majd az oldatot dekantáljuk. Legalább négyszer megismételjük ezt a tisztítási műveletet. 2 mólos nátrium-klorid-oldatban és 0,5 mólos, 5,5-es pH- jú acetát pufferoldatban újra feloldjuk a terméket, majd 4 napon át, az oldatokat mindennap cserélve, 1—1 liter 10 A mólos sósavoldattal szemben dializáljuk az oldatot. A dialízis útján nyert terméket fagyasztva szárítjuk, ily módon 223 mg polimer NAD-származékot nyerünk, X^: 276,5 nm. A polimerhez kötött összes NAD-mennyiségét oly módon határozzuk meg, hogy mérjük a 276,5 nm hullámhossznál észlelhető abszorpcióját, és feltételezzük, hogy extinkciós koefficiense azonos a II általános képletű, ahol n=2, és B a NAD*-ból vezethető le, NAD-származékával (e = 18 800 mól 4 • cm "*). A polimerhez kötött, koenzim, aktivitást mutató NAD- származék mennyiségét élesztőből kivont alkohol dehidrogenázzal 0,1 mólos trisz pufferoldatban, pH = 9-nél, 0,2 mól ’ etanos és 0,5 mól szemikarbazid-hidroklorid jelenlétében végzett kvantitatív enzimes redukció útján határozzuk meg. A keletkezett NADH-származék 340 nm hullámhossznál végzett spektrofotometriás meghatározásából azt az eredményt nyerjük, hogy a polimer minden grammja 115 mikrontól enzimesen redukálható NAD-ot kötött meg, ez a polimerhez kötött NAD teljes mennyisége 90%-ának felel meg. Az ily módon előállított, makromolekulárissá tett NAD több dehidrogenázzal szemben mutat koenzim-aktivitást. Például az élesztőből izolált alkohol dehidrogenáz esetében a makromolekulárissá alakított NAD enzimes redukciójának a sebesség a természetes koenzimének fele. A következő, inkubált keverék 1 ml-nyi mennyiségében végezzük ezt a meghatározást: 83 mikromól trisz-hidroklorid, 166 mikromól etanol, 42 mikromól szemikarbazid-hidroklorid, 0,1 mikromól (polimerhez kötött és enzimesen redukálható NAD-ként kifejezett) koenzim, 0,2 mikrogramm enzim, a meghatározás pH-ja: 9, inkubálási hőmérséklet: 25 C°. A 340 nm hullámhossznál mérhető abszorpció növekedésének meghatározásával mérjük a redukció sebességét. 6 5. példa Nikotinsavamid-8-(3'-polilizil-3'-oxo-propiltio)-adenin-dinukleotid 1 általános képletű vegyület, ahol n=2, az —N=a polilizinből levezethető csoport, és B a NAD* -ból levezethető csoport. 50 mg, kb. 50 000-es mólsúlyú polilizin-hidrobromid 0,5 ml vízzel készült oldatához 40 mg nikotinsavamid 8-(2'-karboxi-etiltio)-adenin-dinukleotid (II általános képletű vegyület, ahol n=2, és B a NAD*-ból levezethető csoport) 0,5 ml vízzel készült oldatát és 40 mg N-etil-N'-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid 0,5 ml vízzel készült oldatát adjuk. 0,1 mólos nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával 4,7-re állítjuk be az oldat pH-ját, és 24 órán át oly módon keverjük az elegy et, hogy az első három órában 0,1 mólos sósavoldat esetenkénti hozzáadásával a 4,7-es értéken tartjuk a pH-ját. A fent leirt körülmények között ezután további 40 mg karbodiimid 0,5 ml vízzel készült oldatát adjuk az elegyhez, majd további 24 órán át kevertetjük. Vízzel 15 ml térfogatra egészítjük ki a reakcióelegyet, centrifugacsőbe töltjük át az oldatot, és 10 ml 0,15 mólos foszfát pufferoldattal 6-os pH mellett kicsapjuk a terméket. 10 percen át 19 000 g-vel centrifugáljuk a szuszpenziót, majd az oldatot dekantálással eltávolítjuk. További tisztítás céljából 1 ml 2 mólos nátrium-kloridoldatban és 0,05 mólos, 5,5-es pH-jú acetát pufferoldatban oldjuk a polimert, vízzel 15 ml-re egészítjük ki az ily módon nyert oldat térfogatát, majd 10 ml 0,15 mólos, 6-os pH-jú pirofoszfát pufferoldattal ismét kicsapjuk a terméket, 10 percen át 39 000 g-vel centrifugáljuk, és az oldat dekantálása útján elkülönítjük a polimert. Legalább négyszer megismételjük ezt a tisztítási műveletet. 2 mólos nátrium-hidroxid-oldatban és 0,05 mólos, 5,5-es pH-jú acetát pufferoldatban újra feloldjuk a terméket, és 48 órán át 500 ml 3 mólos nátrium-klorid oldattal szemben dializáljuk. Ezután négy napon át, az oldatokat naponta cserélve, 10 4 mólos sósavoldat 2 mólos mennyiségeivel szemben dializáljuk a terméket. Fagyasztva szárítjuk a dialízis útján nyert terméket, ily ■ módon 34 mg NAD-származékot polimer nyerünk, 276,5 nm. A polimerhez kötött összes NAD mennyiségét oly módon határozzuk meg, hogy méljük a 276,5 nm hullámhossznál észlelhető abszorpciót, és feltételezzük, hogy extinkciós koefficiense azonos a II általános képletű, ahol n=2, és B a NAD-ból vezethető le, NAD-származékéval (e= 18 800 mól 4 • cm 4). A polimerhez kötött, koenzim-aktivitást mutató NAD- származékok mennyiségét élesztőből kivont alkohol dehidrogenázzal 0,1 mólos trisz pufferoldatban, pH=9-nél, 0,2 mól etanol és 0,5 mól szemikarbazid-hidroklorid jelenlétében végzett kvantitatív enzimes redukció útján határozzuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
