182267. lajstromszámú szabadalom • Eljárás C-15003 P-3 antibiotikum előállítására
11 182267 12 5. táblázat Anti-mikrobiális spektrum Teszt-organizmus IFO 4 szám Táptalaj Idő (óra) Gátlási zóna átmérője (mm) Alternaria kikuchiana 7515 PSA* 48 38 Fusicladium levieri 6477 PSA* 90 68 Helminthosporium sigmoideum var. irreguläre 5273 PSA* 48 55 Pyricularia oryzae — PSA* 48 53 Elsinoe fawcetti 8417 PSA* 90 55 Fusarium oxysporum f. cucumericum PSA* 48 20 Guignardia laricina 7888 PSA* 48 12 Cochlioborus miyabenus 5277 PSA* 48 60 Diaporthe citri 9170 PSA* 48 55 Gibberella zeae 8850 PSA* 48 37 Sclerotinia sclerotiorum 9395 PSA* 90 65 Venturia pirina 6189 PSA* 48 50 Pellicularia sasakii 9253 PSA* 48 50 Pythium aphanidermatum 7030 PSA* 48 58 Botrytis cinerea — PSA* 48 48 Aspergillus niger 4066 PSA* 48 0 Pénicillium chrysogenum 4626 PSA* 48 35 Rhizopus nigricans 6188 PSA* 48 25 Saccharomyces cerevisiae 0209 PSA* 48 0 Rhodotorula rubra 0907 PSA* 48 28 Trichophyton rubrum 5467 GB** 48 38 Mentagrophytes 7522 GB** 48 38 Candida albicans 0583 GB** 48 0 Candida utilis 0619 GB** 48 0 Cryptococcus neoformans 0410 GB** 48 43 PSA* = Burgonya szacharóz agartáptalaj BG**=Glükóz tápagar táptalaj A P-3 antibiotikumot használhatjuk gombaellenes szerként az 5. táblázatban említett mikroorganizmusok által okozott növényi megbetegedések ellen. Jellemző használata során a P-3 antibiotikumot 1% metanolosvizes oldatban 0,5—5 fig/ml koncentrációban alkalmazzuk. A P-3 antibiotikumot lehet például használni szárrothadás, a Helminthosporium levél-pötty és a rizs hüvely-foltosodás ellenőrzésére. A következő példákban a találmány szerinti eljárást részletesen illusztráljuk. A % vegyes-százalékot jelent, az eltérést jelezzük. 1. példa 200 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikba 40 ml inokulum-táptalajt öntünk, melynek összetétele: 1% glükóz, 2% Bacto Trypton (Difco Laboratories, USA) és 1,2% Bacto élesztőkivonat (Difco Laboratories, USA), pH = =7,0. Sterilezés után a C-15003 számú Nocardia fajt oltjuk a táptalajba. Oltóanyag előállítására a lombikot 48 órán keresztül 28 °C-on körkörös rázógépen (200 min-1) inkubáljuk. Az inokulum-tenyészetet háromszor mossuk steril desztillált vízzel, majd a mosott sejteket újra szuszpendáljuk az eredeti térfogatra, steril desztillált vízben. A fenti sejtszuszpenzióból egy millilitert beoltunk 40 ml fő tenyésztáptalajba [3% oldható keményítő, 0,2% ammónium-klorid, 0,05% magnézium-szulfát, 1,09% kálium-dihidrogén-foszfát, 2,09% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,001% vas(II)-szulfát] és a tenyésztést 28 °C-on 48 órán át végezzük a körkörös rázón. Az említett tenyésztés után annyi izobutil-aldehidet adunk a tenyészetbe, hogy a táptalajon az izobutir-aldehid koncentrációja 0,05 térfogat% legyen, és a tenyésztést 6 napig folytatjuk. A tenyésztés befejezése után azt tapasztaltuk, hogy a C-15003 antibiotikum teljes mennyisége 27 mg/1 volt, és a P-3 komponens aránya 95 súly% volt ; másrészt, ha nem adtunk izobulil-alkoholt vagy izobutil-aldehidet a tenyészethez, a P-3 komponens aránya csak 65 súly% volt. (A C-15003 antibiotikum mennyisége 10 mg/1 volt.) Az összes C-15003 antibiotikum mennyiségét és a megfelelő adalékanyagokat a következő módszer szerint határoztuk meg. Az antibiotikum összmennyiségét agar-diffúziós módszerrel határoztuk meg teszt-organizmusként Philobasidium uniguttulatum IFO 0699 gombát használva, és literenként 15 g Trypticase-peptont (Baltimore Biologicals, USA), 5 g fiton-peptont (Baltimore Biologicals, USA), 10 g nátrium-kloridot, 10 g glükózt, 15 g agart tartalmazó táptalajt használva (pH=7,3, desztillált víz). A termelt antibiotikum mennyiségét a vizsgált oldat által okozott gátlási zóna átmérőjét a standard oldat gátlási zónájának átmérőjéhez^viszonyítva számítottuk ki. A termelt P-3 mennyiségét és arányát a következő módszerrel számítottuk ki: Az antibiotikumot tartalmazó folyadék mintához ugyanolyan térfogatú etil-acetátot adunk, majd az oldatot extraháljuk. Az etil-acetátos fázist bepároljuk és szárítjuk, a kapott maradékot az eredeti térfogat 1/100 részének megfelelő etil-acetátban oldjuk, így kapjuk a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálathoz használható mintát. Az így kapott mintát üveglapra felvitt 60 F254 típusú szilikagélre vittük fel (E. Merck), a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálathoz, és vízzel telített etil-acetátot használtunk futtatószerként. A P-3 mennyiségét és arányát a 254 nm-en mért abszorpciós sáv intenzitását és kiterjedését mérve határoztuk meg, Shimadzu kettős-hullámhosszú vékonyréteg-kiértékelőt használva (CS—910 Modell). 2. példa Az 1. példában említett inokulum-táptalajból 500 millilitert 2000 milliliteres Sakaguchi lombikba öntünk, és sterilezőnk. Az inokulum előállítására a táptalajt beoltjuk a C-15003 számú Nocardia fajjal, és 28 °C-on 48 órán át rázógépen tenyésztjük. 200 literes saválló fermentorba 100 következő összetételű inokulum-táptalajt öntünk : 2,0% glükóz, 3,0% oldható keményítő, 1,0% kukoricalekvár, 1,0% nyers szójaliszt, 0,5% Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Japan), 0,3% nátrium-klorid, 0,5% kalcium-karbonát, pH=7,0; a táptalajt 121 =C-on 20 percig sterilezzük. Hűtés után 500 ml fent említett oltóanyaggal beoltjuk, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
