182234. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertések gastroenterítise elleni vakcina előállítására
182234 kor a TGE vírust az előállítási eljárás során ultrahangkezelésnek vetik alá. A találmány szerinti eljárásban ezt az antigénfaktort „TGE—SPA” vagy „SPA” névvel jelöljük, mivel úgy gondoljuk, hogy egy olyan specifikus protein-antigénről van szó, amely a sertéseket a TGE 5 ellen megvédi. Úgy látszik, hogy a TGEV-hez kapcsolódó SPA-faktor mennyiségét az attenuálás csökkenti, vagyis a TGE virulens törzsei valószínűleg viszonylag több SPA-t tartalmaznak, mint az attenuált törzsek. Lehetséges, hogy ezzel a különbséggel van összefüggés- 10 ben az a körülmény, hogy az attenuált törzsekből előállított vakcinák nem képesek azonos mértékű laktogén immunitást előidézni a tenyészkocákban, mint amilyen természetes TGE fertőzés, vagy virulens TGEV-vel végzett kísérleti oltás révén keletkezik. 15 A találmány szerinti eljárás alapját továbbá az a tapasztalat képezi, hogy a találmány szerinti eljárással végzett vakcina-előállításhoz használt TGE—SPA könynyen leválasztható a TGEV-ről vagy a TGE más, szubvirális proteinkomponenseiről, és hogy az SPA olyan 20 fizikai tulajdonságok alapján azonosítható, mint amelyek a specifikus proteinmolekulákra jellemzők, vagyis a fajsúllyal (buoyant density) és az elektroforetikus mobilitással. A következőkben az SPA-faktort és az ebből készíthető vakcinákat részletesen ismertetjük. 25 A találmány szerinti eljáráshoz használt TGE—SPA immunogént olyan TGEV-ből állítjuk elő, amelyet malacok vékonybelében vagy sertés-sejtkultúrában tenyésztettünk. Mivel a TGEV virulens törzsei valószínűleg többet tartalmaznak az előállítani kívánt specifikus anti- 30 génből, előnyösebb a virulens TGEV alkalmazása. Az SPA azonban előállítható sejtkultúrákhoz adaptált TGEV-ből is. Ha a vírus sejtkultúrában szaporodik, akkor előnyös lehet az adaptált, kevésbé virulens törzs használata. Általában azonban olyan TGEV-vel cél- 35 szerű a sejteket fertőzni, amely sertésekben TGE-t képes előidézni. így például az Illinois-ban izolált TGEV-t egyrészt in vivo tenyésztéshez malacbélben is fel lehet használni, másrészt in vitro sertés-sejttenyészetben, mint például heresejt-tenyészetben. Az Illinois-ban izolált 40 törzs standard laboratóriumi vírus, és beszerezhető a Veterinary Services Laboratory, U.S.D.A. Ames, Iowa intézettől és más forrásokból. Megfelelő virulens törzsek könnyen izolálhatok TGE-vel természetes úton fertőzött sertések beléből. 45 A TGEV-t a táptalajból izoláljuk. így például a sertés vékonybelének éhbél részét például őrléssel elaprítjuk, és ebből megfelelő vizes közegben szuszpenziót készítünk. Ehhez hasonlóan a tenyésztett sejteket is szusz- 50 pendálhatjuk megfelelő közegben a további feldolgozás céljára. A szuszpenziót centrifugáljuk, így a bél- vagy sejttörmeléket eltávolítjuk. A felülúszóból a vírust megfelelő kicsapószerrel, például polietilénglikollal vagy ammónium-szulfáttal kicsapjuk. Amikor a kicsapás tel- 55 jessé válik, a csapadékot centrifugálással, például 9500 g mellett 30 percig tömörítjük. Az elválasztott csapadékot a további tisztításhoz ezután megfelelő vizes közegben újra diszpergáljuk. Ezt a tisztítást elvégezhetjük például szakaszos szacharóz-sűrűséggrádiensen végzett sebesség- 60 zónás centrifugálással. A polietilénglikol 6000-rel kicsapott TGEV fajsúlya (buoyant density) 1,122 g/ml. A vírus tehát a 10, 25 és 40°o-os szakaszos szacharózgrádiensen át a 25—40%-os szacharóz-határfelületre ülepedik. 65 A vírustartalmú sávot elkülönítjük. Ekkor a szükséges SPA még a TGEV-hez kapcsolódik, mivel a TGE virion felületének valószínűleg alkotóeleme. Az SPA felszabadítása céljából mechanikai energiával hathatunk a vírusra. Egy előnyös eljárás szerint a TGEV-szuszpenziót ultrahang-kezelésnek vetjük alá. Amikor az SPA lehasad, feloldódik. Ezt a vírusproteint tehát egy szempontból vízoldhatósága jellemzi. A TGEV ultrahanggal kezelt szuszpenziója két, oldatban levő vírusproteint tartalmazhat, mindkettő 1,02— 1,03 g/ml fajsúlyú. Ezeket a proteineket tehát a TGEV maradékából lehet külön-külön, izopiknikus centrifugálással kitermelni, folytonos szacharóz-sűrűséggrádiens alkalmazásával. Az izopiknikus centrifugálást például 18—20 órán át 260 000 g mellett végezzük, 10— 60%-os szacharózgrádienst használva, Az anyag második sávja, amit „B” sávnak nevezünk, s amely körülbelül 6—8% szacharóznak felel meg, az SPA-t a másik proteinkomponenssel együtt tartalmazza. A találmány szerinti eljárással az elkülönített „B” sávot közvetlenül alkalmazhatjuk vakcina készítésére, vagy tovább tisztíthatjuk, hogy az SPA koncentrációját a másik proteinhez viszonyítva megnöveljük. A „B” sáv proteinoldatát laboratóriumi körülmények között tovább tisztíthatjuk például Sepharose 4B vagy Sephadex G 2000 oszlopon végzett gélszűréssel. Ha trisz-konyhasó puffert használunk eluensként, akkor a szükséges immunogén (TGE-SPA) a második eluált frakció, míg az első frakció tartalmazza a hasonló fajsúlyú másik proteint. Ha az eluátum koncentrációja nagyobb, mint ami a vakcinához szükséges, akkor az eluátumot felhígíthatjuk a vakcina készítéséhez szükséges koncentrációra. Ha pedig az eluátum koncentrációja kisebb, mint ami a vakcina készítéséhez kívánatos, akkor az SPA-t különböző eljárásokkal töményíthetjük. Ilyen eljárások az elektroforézis, ultraszűrés, endozmózis, vagy a kicsapás polietilénglikollal vagy más kicsapószerckkel, majd újraszuszpendálás. Ipari termelésnél az SPA izolálására más eljárások is alkalmazhatók, nemcsak az izopiknikus centrifugálás és a gélszűrés. Egyszerűsített ipari termelés esetében például a kicsapott TGE vírust vizes közegben újra szuszpendáljuk, és az SPA felszabadítása céljából mechanikai vagy kémiai kezelésnek (ultrahang, enzimes hidrolízis, detergensekkel végzett lehasítás stb.) alávetjük, majd a molekulaméretek szerinti elválasztás céljából ultraszűrést alkalmazunk. Az SPA a legkisebb oldható proteinmolekula, amely a membránszűrő pórusain átmegy, és így ezt a szűrletből termeljük ki. A maradék vírusrészecskéket és a hasonló fajsúlyú proteinek legnagyobb részét ily módon választhatjuk el az SPA-tól. Az SPA protein, amelyet a találmány szerinti eljárással előállított vakcinákban immunogénként használunk, elektroforetikus mobilitásával is jellemezhető, amit Rfértékkel fejezünk ki. Az Rf-érték, amelyek például nátriumdodecilszulfát és karbamid jelenlétében [Bishop és Roy: J. Virol. 10, 234—243 (1971)] semlegesített körülmények között poliakrilamid-gélelektroforézissel határozunk meg, a humán szérum albuminhoz viszonyított érték. Ilyen körülmények mellett az SPA protein Rf-értéke 1,84 +0,01. A „B” sáv másik, azonos fajsúlyú proteinjének hasonló módon meghatározott Rf-értéke 1,40 ± ±0,01. Ezekből az Rf-értékekből számolva a molekulasúlyokat, az SPA protein molekulasúlya közelítőleg 2
