182209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán leukocita interferon előállítására
----------(19) HU MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS (11) 182209 "A SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Bejelentés napja: (22) 1980. X. 7. (21) (2435/80) Nemzetközi osztályozás: (5l) NSZO3 C 07 G 7/00; C 12 P 21/00; A 61 K 45/02 Közzététel napja: (42) 1983. II. 28. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Megjelent: (45) 1986. VIII. 31. Színacvij«'"’ TULAJ DON Feltalálók: (72) dr. Béládi Ilona orvos, 33,4% dr. Mécs Imre biológus, 33,3%, dr. Tóth Miklós orvos, 33,3%, Szeged Szabadalmas: (73) EGYT Gyógyszervegyészeti Gyár, Budapest (54) Eljárás humán leukocita interferon előállítására 1 Találmányunk humán leukocita interferon javított előállítási eljárására vonatkozik. Ismeretes, hogy az interferon vírusellenes hatással rendelkező fehérjeszerkezetű anyag, melyet gerincesek sejtjei vírusfertőzés hatására termelnek (3 699 222 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Az idézett szabadalmi leírás szerint az interferon termelésére például csirke allantois membrán, csirke embrió fibroblaszt, majom vesesejtek, nyúl vesesejtek, vagy emberi sejtek alkalmazhatók. Interferon továbbá az emberi vér leukocita frakcióiból is előállítható. Az eljárás során a vér fehérvérsejtjeit nagy szérumkoncentrációjú, esszenciális aminosavakat tartalmazó táp-oldatban szuszpendálják, majd valamely interferon induktorral (pl. Sendai vírus, Newcastle vírus, parainfluenza vírus, stb.) inkubálják. A sejtek centrifugálással vagy szűréssel történő eltávolítása után nyert folyadék illetve szürlet nyers interferont tartalmaz. A 3 800 035 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint az interferon tisztasága oly módon fokozható, hogy a humán leukocitákat szérum-tartalmú tápoldatban előbb 10—200 N.E./ml interferonnal 5—120 percen át kezelik, a sejteket a szérumtartalmú tápoldattól elválasztják, majd szérummentes tápoldatban szuszpendálva kezelik a megfelelő interferon induktorral. Ily módon az indukciót szérum mentes közegben végzik el és ezáltal a szérum fehérjeivel kevésbé szennyezett interferont kapnak, melynek az idegen fehérjéktől történő mentesítése során kisebb interferonveszteség lép fel. Az interferon-koncentráció a szabadalmi leírás szerint mindössze 15 000—16 000 N.E./ml. Az irodalom szerint az interferon-induktorral történő ke-2 zelést bonyolult összetételű, esszenciális aminosavakat tartalmazó tápoldatban végzik el. A 3 800 035 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint e célra az összes esszenciális aminosavat tartalmazó tápoldatokra van 5 szükség. Az alkalmazott Eagle-féle alap esszenciális közeg (BME) és minimális esszenciális közeg (MÉM) L-arginint, l.-cisztint L-glutamint, L-hisztidint, L-izoleucint, L-leucint, L-lizint, L-metionint, L-fenil-alanint, L-treonint, L-triptofánt, L-tirozint, L-valint, továbbá biotint, D-kalcium-panto- 10 tenátot, kolin-kloridot, fólsavat, inozitot, nikotinamidot, piridoxint, riboflavint, és tiamint tartalmaz. A fenti oldatok rendkívül drágák, készítésük pedig igen bonyolult. BME- tápoldat alkalmazását javasolják Cantel K. és munkatársai is [„Publication of the Tissue Culture Association” 3. sz. 15 monográfia (1974)]. Kísérletek történtek a fenti igen költséges esszenciális aminosavakat tartalmazó oldatok egyszerű puflerekkel történő helyettesítésére, ezek azonban nem jártak a kívánt eredménnyel. A 79.95795 sz. vizsgálat nélkül nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés (Kokai) 20 szerint tápoldatként az úgynevezett PBS-oldatot (Phosphate Buffered Saline) alkalmazzák, mely 132,5 mg/1 kalcium-klorid-dihidrátot, 200 mg/1 kálium-kloridot, 200 mg/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 100 mg/1 magnézium-klorid-hexahidrátot, 8000 mg/1 nátrium-kloridot, és 1150 mg/1 dinátri- 25 um-hidrogén-foszfátot tartalmaz. Az elért interferon-titer azonban nem egészen 30%-a a MÉM tápoldat alkalmazása esetén kapott értéknek. Az említett japán szabadalmi bejelentés értelmében a PBS-oldatot glutaminnal (300 mg/1) egészítik ki, azonban az ily módon készített oldat is drága 30 aminosav komponenst tartalmaz. 182209 1
