182171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminoaciláz enzim elkülönítésére emlősök veséiből
182.171 tumot 1 óra hoaazat jeges vízfürdőben kevertettük, majd centrifugáltuk. A felüluazót 70 C°-ra melegítettük fel éa 10 percig ezen a hőmérsékleten tartottuk, majd jeges vízfürdőben lehütöttük éa centrifugáltuk. A felüluazóhoz 1200 g ammóniumazulfátot adtunk. Egy éjszakai álláa után a azuazpenziót centrifugáltuk. A caapadékot kevés hideg /+4 C°-oa/ desztillált vizben feloldottuk, éa deaztillált vizzel azemben aómenteare dializáltuk. Dializis után az oldatot azürtük, majd liofilizáltuk. Kitermeléa: 3,8 g aminoaciláz. Aktivitás: 319 /imól N-acetil-L-metionin hidrolízise/ /óra/mg fehérje. 6. példa. 3 g, a 3» példa szerint elkülönített sertésvese-aminoacilázt 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban /pH = 7,0/ oldottunk, éa az oldathoz 50 g, előzetesen ugyanezzel a pufferoldattal egyensúlyba hozott DEAE-Spehadex A-50 gyantát adunk. Az igy kapott azuazpenziót 3 órán át jeges vizfürdon kevertéttűk,majd éjszakán át hűtőszekrényben /+4 C°-on/ állni hagytuk. Másnap a gyantát háromszor 1 liter fenti pufferoldattal mostuk, majd ujabb 1 liter fenti puff eroldatban felvéve egy 5,3 cm átmérőjű,- 55 cm magas oszlopba töltöttük. A gyantaoszlopot 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldattal /pH = 7,0/ eluáltuk 200 ml/óra átfolyási sebességgel. Az effluenst 100 ml-es frakciókba gyűjtöttük. Az enzimaktivitást tarr talmzaó frakciókat összeöntöttük, éa az oldathoz 80 g ammóiumazulfátot adtunk. Kitermelés: 0,7 g aminoaciláz. Aktivitás: 5240/imól N-acetil-L-metionin hidrolizise/óra/mg fehérje. 7« példa A 6. példa szerint előállitott enzimszuszpenzióból 25 ml-t /57 mg feherje/ centrifugáltunk, és a csapadékot 9 ml 0,05 mólos káliumfoszfát-pufferoldatban /pH = 7,0/ oldottuk. Az oldatot egy, előzőleg a fenti puff eroldattal átmosott, 2,4 cm átmérőjü, 43 cm magas Sephadex G-200 oszlopra vittük fel. A géloszlopot a fenti pufferoldattal eluáltuk 60 ml/óra átfolyási sebességgel. Az effluenst 5 ml-es frakciókba gyűjtöttük. Az enzimaktivitást tartalmazó frakciókat összeöntöttük, és az oldathoz 9 g ammóniumszulfátot adtunk. Kitermelés: 25 mg aminoaciláz. Aktivitás: 10 000 yumól N-acetil-L-metionin hidrolizise/óra/mg fehérje. ..................... ;......................"...... Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás aminoaciláz enzim elkülönitésére vizes emlősvese extraktumból azzal jellemezve, hogy az extraktumot 5-15 percig 60-80 0°-on hőkezeljük, a hőkezelt elegyet centrifugáljuk, a felüluszóhoz literenként 200-300 g K^A általános képletíl pót adunk - ahol K egyvegyértékü kationt jelent, A valamely pzervetlen sav anionját jelenti, és x egyenlő az anion vegyértékével -, a kapott szuszpenziót centrifugáljuk, az elkülönített psapadékot vizben oldjuk és vizzel szemben dializáljuk, majd kívánt esetben a dializált oldatot, illetve az oldatból elkülöni-» tett enzim 6,5 és 8,5 közötti pH-értékü pufferoldattal készitetf pldatát anioncserés kromatográfiának vetjük alá, végül kivánt 'esetben az anioncserés kromatográfia során kapott aktiv frakci-* ókat, illetve az aktiv frakciókból K^A általános képletü sóval h fenti módon végzett kicsapással elkülönített enzim 6,0 és 8,0 közötti pH-értékü pufferoldattal készitett oldatát gélkromatog-6
