182087. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a normál és leukémiás mieloid sejtek szaporodását szelektíven gátló hatóanyagok előőllítására
182.087 /összetétele: 9500 g dinátrium-hidrofoszfát.2Hp0 és 1,815 g káli um-dl hi dx of ősz fát 1 liter desztillált vizben/ 800 g-vel történő centrifugálással mossuk. A kapott granulocyta-üledéket ugyancsak a fenti összetételű foszfát-pufferben 4,lo9 sejt/ml sűrűségben szuszpendáljuk és Potter-homogenizátorban, percenként 10 húzással homogenizáljuk. A kapott homogenizátumot 1500 gj-vel 50 percig centrifugáljuk, majd az elkülönített szupernatans folyadékot ultraszürésnek vetjük alá Amicon PM 10-es membránnal, 5 atm nyomás alkalmazásával. Az igy kapott szürletet liofilizáljuk és a liofilizátumot 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-pufferoldattal /pH = 7,9/ Seçhadex G-10-ea oszlopon gélkromatografáljuk. A v /v = 1,15 es 1,4-5 között leváló frakciót elkülönítjük és liofilizáljuk. Ily módon 65 mg szilárd hatóanyag-koncentrátumot kapunk /GI-5 frakció/. 2. példa GI-3 frakció előállítása borjulépből 1 000 g kötőszöveti tokjától megtisztított és aprított borjuléphez 4- liter össztérfogatig 4 °C hőmérsékletű acetont adunk, az elegyet ezen a hőmérsékleten homogenizáljuk és 60 percig inkubáljuk, majd centrifugáljuk, az elkülönitett üledéket acetonnal mossuk és vákuumban 20 °G hőmérsékleten megszánt juk. A száraz anyagot 2 liter kloroformmal 30 percig extraháljuk, a szilárd részt elkülönítjük, szobahőmérsékleten megszáritjuk és 3 liter kétszer desztillált vizben 16 órai keveréssel oldjuk. Az oldatot 20 000 g-vel 1 óra hosszat centrifugáljuk, a szupernatáns folyadékot először Amicon XM 50-es, majd ezt követően PM 10-es membránon át 3 atm nyomás alkalmazásával szűrjük és a szürletet liofilizáljuk. A kapott liofilizátumot 0,05 mólos ammónkum-hidrogén-carbonát-puffer-oldattal /pH = 7,9/ Sephadex G-15 oszlopon gélkromatografáljuk. A v /v = 1,3 és 2,5 között leváló frakciót elkülönítjük és liofilizáljuk. Ily módon 3,54- g szilárd hat óanyag-koncentr át umot /GI-3 frakció/ kapunk. 3. példa Tiszta GP hatóanyag előállítása 300 mg GI-3 hatóanyag-koncentrâtumot /amelyet az 1. vagy 2. példa szerint állítottunk elő/ Whatman 3MM kromatográfiás papírra visszük, a kiindulást a papir közepén elhelyezve. A felvitt minta teljes mennyiségét 30 cm hosszan osztjuk el. Az elektroforézist 6.5 pH-értékü píridin-ecetsav-pufferelegyben /piridin-ecetsav es viz 90:4:900 arányú elegye/, horizontális elrendezésű elektroforézis-készüléken, 50 V/cm feszültség-grádienssel. 2 óra hosszat végezzük. A savas jellegű ninhidrinnegativ es klór-pozitiv komponens helyzetét klór-tolidines festéssel határozzuk meg. Az igy kapott aktiv komponenst a papírról ecetsav, hangyasav és viz 8:2:90 arányú elegyével eluáljuk, majd ebben az 1,9 pH-értékü pufferelegyben újabb elektroforezisnek vetjük alá 80 V/cm feszültség-grádienspel, 90 percig folytatva az elektroforézist. A töltéssel nem rendelkező komponens /GP hatóanyag/ helyzetét klór-tolidin-reakcióval határozzuk meg; az igy kapott hatóanyagot a papírról a fenti össze-5
