182087. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a normál és leukémiás mieloid sejtek szaporodását szelektíven gátló hatóanyagok előőllítására
182.087 b/ granulocytákat tartalmazó állati szerveket, célszerűen borjulépet acetonban homogenizálunk, a folyékony homogenizátumot cehtrifugáljuk, az üledéket kloroformmal extraháljuk, majd a szilárd maradékot vizzel elkeverjük, centrifugáljuk, a szupernatáns folyadékból molekulaszüréssel elkülönítjük a 10 000-nél kisebb molekulasulyu frakciót, ezt gél-kromatografálásnak vetjük alá és az 1,5 és 2,5 közötti ve/vQ térfogatnál leváló frakciót /az aktiv és specifikus frakció a %-timidin, mint marker elucióa maximuma és a vQ közé határolható be/ liofilizáljuk, majd az a/ vagy b/ eljárás szerint kapott terméket /a továbbiakban: "GI-5 frakció”/ ionos töltés és méret alapján frakcionáló, ioncserélő kromatográfiás technikával /például Dowex 50x8 oszlopkrómatográfiával/, illetve papirelektroforézissel tisztítjuk és a 6,5 pH-értéknél negativ töltésű, az aszparaginsavhoz viszonyítva -0,55 és -0,65 közötti mózgékonyságu, 1,9 pH-értéknél töltéssel nem rendelkező, £-DNP-lizinhez viszonyítva 0,26 mozgékonyságu, klór-tolidinra pozitív peptidet elkülönítjük. A papírról eluált Oligopeptid-jellegű termék liofilizálással különithető el; a tiszta, kémiailag egységes hatóanyag /a továbbiakban: ”GP” = granulopeptid/ 6,5 pH-értéknél negativ töltésű, az aszparaginsavhoz viszonyított relativ mozgékonysága -0,55 és -0,65 között van; 1,9 pH-értéknél töltése nincs, -DNP-lizinhez viszonyított mozgékonysága 0,26; szabad amino-végcsoportja nincs; az aminosav-análizis eredményei szerinti összetétele: Aspj , Se^, Thr.p G^u2* A^a2» ■Prol» etanolamin^. A találmány szerinti GP hatóanyag szelektiv hatású, specifikusan csak a myeloid sejtek /egér és patkány granuloid sejtek, transzplantábilis állati myeloid leukémiás sejtek, spontán emberi akut myeloid leukémiás sejtek/ szaporodását gátolja, ellenben a normális thymocytákra, PHA-stimulált lymphocitákra, subacut lymphoid leukémiás thymocytákra, emberi lymphoid leukémiás vérsejtekre és HeLa humán daganat-sejtekre hatástalan. A találmány szerinti eljárás közbenső termékeként kapott GI-3 részlegesen tisztitott frakció természetesen szintén tartalmazza a GP hatóanyagot, kevésbé aktiv komponensek és túlnyomó mennyiségű inaktiv szennyezés kíséretében. Ez a GI-3 frakció is mutat a GP-hatóanyagtartalomnak megfelelő mértékű specifikus gátló hatást a myeloid sejtek szaporodásával szemben; in vitro kis érietekben a GI-3 frakció minimális hatékony dózisa /MED/ a 5ű-timidin savoldhatatlan DNS-be épülésének gátlásakor 110 ng/ ' ml, az agar-gélben képződő kapilláris kolóniák esetében 8 /dg/ml. Á megfelelő ED^q értékek 4-30 illetve 90/ug/ml. A hatóanyag fizikai-kémiai és sejtbiológiai jellemzői: Hatástartam szuszpenziós kultúrákban;?*^^ gélkolóniákban 1 hét. Nem toxicus, mert 51cr-releaae teszttel mérve nem csökkenti a sejtek vitalitását. Támadáspontja a sejtciklus G, fázisa. Termostabilitás: 60 percig 80 °C hőmérsékleten tartva biológiai aktivitását és a hatás specificitását hem veszíti el; oldatban 37 °C hőmérsékleten 72 óra alatt hatásossága nem csökken. Liofilizátumként -20 °C-on ^7 héten át, aceton vagy kloroform-por alakjában +4 °C-on p=*18 hónapig tárolható. Az ioncserélő krómatográfiával, illetve papirelektroforézissel izolált és visszatesztelt GP hatóanyag hatásosságának valamint a GI-3 frakció és a tiszta GP hatóanyag aktivitásának 3
