181994. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált peritonítisz vakcina előállítására
3 181994 4 toneális folyadék vagy vizelet e célra történő alkalmazása esetén ezt a fertőzött folyadékot közvetlenül olthatjuk rá a kiválasztott sejtkultúrákra. A vírusnak az állat véréből történő elkülönítése oly módon történhet, hogy a fertőzött állatot a juguláris vénából vagy bármely más alkalmas vénából véreztetjük, az így kapott vér-mintát megalvadni hagyjuk, majd például mozsárban eldörzsöljük az alvadékot és valamely erre alkalmas közegben, például foszfát-pufferes sóoldatban újra szuszpendáljuk. A szuszpenziót ezután centrifugáljuk a durva szövet-törmelékek eltávolítása céljából, a szupernatáns folyadékot elkülönítjük és ezt használjuk fel a sejt-kultúrák beoltására. Elkülöníthető a vírus az állatok különféle szerveiből, például a májból, lépből vagy csepleszből (omentum) is ; ilyen esetekben a beoltásra alkalmas vírus előállítása hasonló módon történhet, amint ezt a véralvadék esetében ismertettük, vagyis a fertőzött szervet eldörzsöljük, újból szuszpendáljuk, a szuszpenziót centrifugáljuk, a szupernatáns folyadékot elkülönítjük és ezt használjuk fel a sejt-kultúrák beoltására. A virulens vírusok sorozatos passzázsának végrehajtására alkalmas macska-embrió sejt-kultúrákat a macskafélék fajához tartozó bármely állat embriójának tüdejéből, veséjéből, szívéből, májából, beléből vagy más alkalmas szervéből vagy ilyen szervek keverékéből vehetjük ; alkalmas szövetek nyerhetők erre a célra a bőrből, izmokból, placentából vagy a nyelvből is. A sejt-kultúráknak a macska-embrió különböző részeiből, vagy akár az egész embrióból történő előállítása olyan módszerekkel történhet, amilyeneket az 1 177 635 és 1 286 250 sz. brit szabadalmi leírások, valamint a J. Hygiene, 67, (1969), 115—124 közlemény ismertetnek. Az idézett szabadalmi leírások a diploid sejt-törzsek előállítására alkalmas eljárást ismertetnek, míg az utóbb idézett közlemény heteroploid sejtvonalak előállítására szolgáló eljárást ír le. A módszerek lényege az, hogy az embriót vagy annak az e célra választott részét mechanikai vagy enzimes úton felaprítjuk, a kapott sejt-szuszpenziót valamely sejt-kultúra tenyésztésére szolgáló közeget magába fogadó edénybe visszük és 32—39 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A szubkultúra-tenyésztés megkönnyítésére célszerű az egybefolyó sejt-lapokat tripszinnel vagy valamely ártalmatlan kelátképző anyaggal kezelni az újabb friss közegbe történő átvitel előtt. Alkalmazhatunk azonban a fertőző macska-hashártyagyulladásvírus tenyésztésére primer macska-sejtkultúrákat is ; ezek előállítási módja a szakmabeliek által jól ismert. Az elkülönített virulens fertőző macska-hashártyagyülladás vírus tenyésztése oly módon történhet, hogy az e célra választott macska-embrió sejtek egysejt-rétegét vagy sejt-lapját beoltjuk a fertőzött állatból származó vírus-készítménnyel, majd a beoltott sejt-kultúrát 35 °C és 39 °C közötti, előnyösen 37 °C hőmérsékleten 3—10 napig, előnyösen 5—8 napig inkubáljuk valamely erre alkalmas közeg jelenlétében. Közegként célszerűen valamely kémiailag definiált anyagot alkalmazunk biológiai adalékok, például szérum hozzáadása nélkül. Ilyen célra alkalmas közegek példáiként az Eagle-féle alap-közeg [Eagle H., Science, 130, 432 (1959)] vagy a „199” fenntartó-közeg [Morgan J. F. és munkatársai, Proc. Soc. Exp. Biol. (N. Y.), 73, 1 (1950)] említhetők. A közeghez adhatunk valamely baktériumellenes szert, például penicillint és/vagy sztreptomicint is. Az inkubálás befejezése után a vírust mechanikai módszerekkel, például fogyasztással és felolvasztással különíthetjük el; az így kapott vírus-készítményt azután a szokásos szövetkultúra-módszerekkcl (vö. : A Manual of Basic Virological Techniques, G. C. Rovozzo és C. N. Burk, Prentice- Hall Inc., Eaglewood Cliffs, N. J., USA, 1973) alkalmazzuk a macska-embrió sejtek egysejt-rétegű kultúráinak sorozatos passzázsolására. A vírus első néhány, rendszerint körülbelül 5 passzázsa során nem tapasztalható nyilvánvaló citopátiás hatás a sejteken. Ezután azonban az egysejt-rétegű sejtkultúráknak a FlP-vírussal történő további fertőzése a fertőzött sejteken jellegzetes szabálytalan alakok kialakulását idézi elő, amelyek mikroszkóp alatt, nedves készítményekben jól megfigyelhetők, végül azután a sejtek kikerekednek és/vagy leválnak arról a szilárd felületről, amelyen tenyésztettük őket. így végülis a vírus teljesen elpusztítja az egysejt-rétegű kultúrát. A FIP-vírus elektronmikroszkóp alatt a corona-vírusfélék egyéb képviselőihez hasonló alakot mutat, lényegileg gömbölyű, 80—160 nm átmérőjű alakban, körülbelül 25 nm hosszúságban kiálló nyúlványokkal, amelyek ezeknek a vírusoknak dicsfény- vagy koronaszerű megjelenést kölcsönöznek. Az egyes passzázsokból kapott vírus titere körülbelül 104’0 TCID50 és 1010'0 TCIDJ0/ml között változik; TCID50 a sejt-kultúrának azt a fertőző adagját jelenti, amely a vírus-fertőzésnek kitett kultúra sejtjeinek 50%-án okoz citopátiás hatást. Amint a FlP-vírussal fertőzött sejt-kultúrák már citopátiás hatást mutatnak, a sejt-kultúrát összegyűjtjük és a vírust inaktiváljuk, ami például kémiai eszközökkel, mint formaldehiddel, acetil-etilén-iminnel, [i-propiolaktonnal, p-etilén-iminnel vagy más ismert vírus-inaktiválószerrel történhet. Ha formaldehidet alkalmazunk inaktiválószerként, akkor a kultúrák összegyűjtése után a vírus-szuszpenziót például 0,08% formaldehid hozzáadásával inkubáltatjuk mindaddig, míg a vírus teljes inaktiválódását el nem érjük ; ez rendszerint 72 órát meghaladó inkubációt igényel. Ezután a formaldehidet valamely erre alkalmas szerrel, például nátrium-metabiszulfittal semlegesítjük és a szuszpenziót foszfáttal pufferezett sóoldattal szemben dializáljuk a nátriummetabiszulfit feleslegének eltávolítása céljából, mert a jelenlevő nátrium-metabiszulfit zavarná a következő biztonsági vizsgálatokat. Történhet a vírus inaktiválása fizikai módszerekkel, például ibolyántúli besugárzással is. Mielőtt a fenti módon inaktivált vírust vakcinává alakítanék, először meg kell vizsgálni a vírus-készítményt élő vírusoktól való mentesség, sterilitás és hatékonyság szempontjából. Az élő vírusoktól való mentesség vizsgálata céljából a készítmény egy mintáját macska embrió-sejt-kultúrán inkubáltatjuk. Ha a sejt-kultúrán nem mutatkozik citopátiás hatás, ez azt mutatja, hogy élő vírus nincsen jelen. A sterilitás vizsgálata céljából táptalajt és húslevet oltunk be a szuszpenzióval. A hatásosság vizsgálata azon alapul, hogy a készítmény macskákon antítpst-titert idéz elő, ha az inaktivált vírus-szuszpenziót ismert hígításokban injekció útján beadjuk az állatoknak. A fenti módon kapott inaktivált vírus-szuszpenzió vakcinává történő alakítására alkalmas, gyógyszerészeti szempontból elfogadható vivőanyag valamely ilyen célokra alkalmas folyadék, például tápanyagokat és stabi-5 10 15 20 26 30 35 40 45 50 55 60 65 2
