181957. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fogszuvasodást gátló fehérje jellegű antigén preparátumok előállítására
9 181957 10 5. példa A teljes sejtek immunogenitása Fentebb már említettünk leírásokat, melyek majmok sikeres immunizálásáról számolnak be Streptococcus mutáns teljes sejtjeivel (Bowen et al: Brit. Dent. J, [1975], és Cohen et al: Brit. Dent. J. [1979]). A fogszuvasodás csökkenésének mértéke 50%-os vagy még nagyobb volt. Az egyik kísérlet során 4 kísérleti és 2 kontroll állatot kezeltek megölt teljes sejtekkel (Cohen et al: Brit. Dent. J., 147, 9—14 [1979] 14-es állatcsoport). Az injekciókat a nulladik, második, ötödik, hatodik, tizenkettedik és tizennyolcadik hónapokban adták. Az átlagos antitest (IgG) szint a kísérleti és a kontroll csoportban az 1. ábrán látható. Tizenkét hónap után az antigén A-val szemben termelt antitest szintje legalább harmincszorosa volt a kontroliénak, bár ezt a szintet két injekció közti időben mértük. Hangsúlyozni kell, hogy valószínűtlen, hogy ilyen sok injekció kell a védettség eléréséhez, de ebben az irányban még nem folytak kutatások. Négy évvel a kísérlet megkezdése után a kontrollcsoport állatainak átlagban 5 maradandó foguk volt szuvas, míg az immunizált állatoknak általában kettő. Az eredményekből látható, hogy nyilvánvaló összefüggés van az antigén A antitestjeinek szintje és a fogszuvasodás elleni védelem között. Nem immunizált egyedekben az antigén A antitestjei csak ritkán és kis mennyiségben vannak jelen. Ilyen „természetes antitestje” az antigén B-nek is van és azt néhány esetben kimutatták. Nem ismeretes, hogy ezek az antitestek mikor keletkeznek, hogy a fogakon levő Streptococcus mutáns antigénje hatására jönnek-e létre, szisztemikus Streptococcus mutáns fertőzés eredményezi-e vagy más baktériumok antigénjeivel való keresztreaktivitás révén képződnek-e, mely baktériumokkal szemben az állatnak van immúnválasza. Egy másik kísérletben egy nyolc majomból álló csoportot immunizáltak a lábszárba adott, teljes sejteket és alumíniumhidroxid adjuvánst tartalmazó szubkután injekcióval (Cohen et al: Brit. Dent. J., az ezen példában már hivatkozott cikk). A kontrollcsoport is 8 állatból állt. Ebben a 11-es jelű állatcsoportban az antigén A antitestjeinek szintje az összes kontroll állatban emelkedett, az átlagos titer 1/520 volt. (Megjegyezzük, hogy az eljárás változtatása miatt a különböző csoportoknál kapott titerek nem hasonlíthatók össze.) A teljes baktériumsejtekkel immunizált állatoknál az átlagos titer hat hónappal az injekció után 1/2830 volt — a kontroliénak csaknem ötszöröse. Az immunizált állatokban az antigén B antitestjei is jelen voltak. A kontrolihoz képest az immunizált állatoknál a fogszuvasodás 55%-os csökkenését észlelték. 6. példa Az elválasztott sejtfalak immunogenitása A korábban leírt immunizálás az Ingbritt-törzs különválasztott sejtfalaival (Bowen et al: Brit. Dent. J., 45—48, [1975]) védettséget biztosított ennek a törzsnek az újabb fertőzése ellen. A tripszinnel kezelt sejtfalakkal végrehajtott immunizálás nem eredményezett védettséget, ami azt bizonyítja, hogy a védekezés kiváltásában fehérjetermészetű anyag játszik szerepet. Szérumot vettek 4, az Ingbritt-féle törzs sejtfalpreparátumával immunizált, majd ugyanezzel a törzzsel fertőzött C csoportba tartozó majomtól (Bowen et al). Öt kontroll állatot hasonlóan fezeitek immunizálás nélkül. A kontroll állatok antigén A antitest titerje 3 állat esetében 1/20-nál kisebb volt, egy állatnál 1/80-ad és egy állatnál 1/1280-ad volt, míg az immunizált és védett állatok esetében a titer 1/80-ad és 1/640-ed között volt; átlagértéke 1/220-ad. Ezeket az értékeket az utolsó injekció beadása után 20 hónappal vett szérum mintákból állapítottuk meg. A szintek természetesen közvetlenül az injekció után magasabbak is lehettek. Öt évvel a kísérlet megkezdése után a négy kísérleti állatnál összesen négy fogszuvasodás esetet tapasztaltak. Az őt kontroll állatnál összesen hatvannégy fogszuvasodás esetet tapasztaltak, és a fogszuvasodások száma fordított arányban állt a szérumban levő antitest mennyiségével, a legnagyobbfokú szuvasodás annál a két állatnál következett be, melyek egyáltalán nem mutattak antitest választ. Kilenc évvel a kísérlet megkezdése után öt állat volt életben, miután kettő-kettő az immunizált és a kontrollcsoportból elpusztult. A három élő kontroll állat mindegyikénél erősen fokozódott a fogszuvasodás, 56, 69, 93 megtámadott fogfelületük volt. Az egyik immunizált állatnál egyetlen fog romlott el kismértékben, míg a másiknál fogszuvasodás egyáltalán nem következett be. 7. példa A tiszta antigén A immunogenitása A fenti eredményekből látható, hogy a teljes sejttel vagy baktérium sejtfallal a szervezetbejuttatott antigén A és B alkalmas immúnválasz kiváltására adjuváns nélkül (C csoport) vagy alumínium-hidroxid adjuváns egyidejű hozzáadásával (11. csoport). A tiszta antigénekkel való immunizáláskor azonban gyors és tartós hatás kiváltásához szükséges adjuváns jelenléte is. Egyetlen majom immunválaszai (testsúlya körülbelül 5 kg), melyet 50/ug antigén A-val immunizáltunk (az antigént a fent leírt ammónium-szulfátos kicsapással készítettünk), alumínium-hidroxid hozzáadása mellett a 2. ábrán láthatók. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás fogszuvasodást gátló, fehérje-jellegű antigén preparátum előállítására Streptococcus mutáns (NCIB 11 516) mikroorganizmus tenyésztésével, a tenyészetből legalább a sejtfalak eltávolításával, és a kapott proteinoldatból az antigén preparátum kinyerésével, azzal jellemezve, hogy az antigén preparátumot a fehérjeoldatból — kívánt esetben egyszeri vagy többszöri előzetes kicsapás után — affinkromatográfiásan nyerjük ki immobilizált, egy vagy több antigénre specifikus antitesteken, amelyek specifikusak A) körülbelül 29 000-es molekulasúlyú és 4,1—4,5 izoelektromos pontú fehérje-jellegű antigénekre, amelyek az I genetikus csoportba tartozó Streptococcus mutáns törzs baktériumainak sejtfalában forró, vizes, 10 g/1 koncentrációjú nátrium-dodecil-szulfát-oldattal 20 percig végzett extrakció után visszamaradnak, vagy B) az A) pontban definiált fehérje-jellegű antigénekkel reakcióba lépő fehérje-jellegű antigénekre. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy olyan immobilizált antitestet alkalma5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 '60 65 5
