181954. lajstromszámú szabadalom • Készítmény és eljárás vér és más fenilalanin-tartalmú folyadékok fenilalaninszintjének csökkentésére
3 131954 4 való közvetlen bevezetése az enzim kifejezett antigén jellege miatt, amely egy vagy két beadás után magának az enzimnek a gyors eltűnését okozza. Ezzel kapcsolatban például megemlítjük R. R. Fritz, D. S. Hodgins és C. W. Abell szerzőknek a J. of Biol. Chem. folyóirat 251. kötete 4646. oldalán 1976-ban megjelent cikkét. Ezek a szerzők, miután az enzimet beadták a kísérleti állatoknak, azt észlelték, hogy az első beadáskor kapott felezési idők (22 óra) jelentős mértékben megrövidülnek az ezután következő beadásoknál. Olyan antitest jelenléte, amely fajlagos az enzimre, egyidejűleg észlelhető. Azt találtuk, hogy hasznosítni lehet ezt az enzimet fenilketonuriában szenvedő betegek váráramában anélkül, hogy az enzimkivetés jelenségét észlelnénk, ami akkor jön létre, amikor az enzim hosszú ideig marad a véráramban. Az enzimet megkötjük a 836 462 számú olasz szabadalmi leírásban ismertetett módon porózus cellulóztriacetát-szálakban, amelyeket biokompatibilissá teszünk oly módon, hogy a polimer fázishoz egy, a vérlemezkék aggregálódását akadályozó anyagot, így 4,5-difenil-2-bisz(2-hidroxietil)aminooxazolt adunk. Abban az esetben, ha így járunk el, olyan készítményt kapunk, amely lehetővé teszi a vérben lévő fenilalanin koncentrációjának a beállítását fehérjekatalizátor nélkül, amelyet a vérrel közvetlen érintkezésben használunk. Ezenkívül a nagy felület/térfogat arány csökkenti a diffúziós hatásokat, azaz az anyag bejutásának a gyorsaságát a katalitikus területekre. Az ily módon készített anyag biokompatibilis, azaz közbejövő zavarok, így vérlemezadhézió, vérrögképződés és hasonlók, nélkül használható. Végül az anyag alkalmazható táplálékként is használt fehérjehidrolizátumok kezelésénél, annak érdekében, hogy a fenilalanintartalmat szelektív módon olyan tartományban tartsuk, amely elviselhető fenilketonuriában szenvedő betegek számára. Ennélfogva fenilketonuriában szenvedő betegek által elfogyasztható táplálék előállításának az útja eddig az volt, hogy fáradságos kromatográfiás módszerrel szétválasztották a fehérjehidrolizátumokat és ezt követően újra létrehoztak egy szigorúan arányos keveréket, amelyből a fenilalanint kizárták. Ezzel szemben a találmány lehetővé teszi fenilalaninnak fehérjehidrolizátumból való kinyerését, ennek csupán a fent említett szálakkal való kezelése útján. Ilyen anyagok készítésének és használatának a részleteit a következő példákon közelebbről is bemutatjuk anélkül, hogy a találmány körét a bemutatott megoldásokra korlátoznánk. A készítést a szakember a találmány szerinti elvek alapján a hatóanyagok természetének és az alkalmazás módjának megfelelően könnyen előállíthatja és alkalmazhatja a vér tisztítására. 1. példa 20 g cellulóz-triacetát és 7 g 4,5-difenil-2-bisz(2-hidroxi-etiljamino-oxazol 930 ml metilén-kloriddal készített oldatához 2 "C-on 140 ml trisz-pufferes (0,05 mól HC1, pH = 7,5) fenilalaninammónialiáz-oldatot adunk, amely 30% glicerolt is tartalmaz. Az enzim-oldatot úgy kapjuk, hogy az enzimet Rhodotorula glutinis-ből extraháljuk és 2,1 mikromol/min. milligramm protein aktivitás eléréséig protamin-szulfáttal, ammónium-szulfáttal és nátrium-citráttal való kicsapással tisztítjuk. Az oldat aktivitása 113 U (egység) milliliterenként. Keverés közben emulziót kapunk, amelyet azután nitrogéngáz nyomással egy toluolos koaguláló fürdőbe merített fonófejen keresztül extrudálunk. A toluolos fürdőben a polimer koagulálása folytán szál képződik, amelyet forgódobra viszünk és nitrogénárammal kezelünk a fonóoldószerek eltávolítása érdekében. Két gramm szálat egy 7 mm belső átmérőjű és 500 mm hosszúságú nyloncső falán körgyűrű formában elrendezünk. A nyloncsövet előzetesen kezeljük a 869 323 számú belga szabadalmi leírásban megadott módon, annak érdekében, hogy a csőfal trombogén hatását megszüntessük. A fent leírt módon egy második enzimes reaktort is készítünk. A két reaktort sorba kapcsoljuk és egy olyan rendszerbe szereljük be, amely egy 37 °C-ra szabályozott termosztatikus tartályból és egy szivattyúból, valamint a két reaktorból tevődik össze. A tartályba 400 ml vért teszünk és hozzáadunk nátriumcitrátot és fenilalanint (0,7 mikromól milliliterenként). A vért 4 ml/sec sebességgel áramoltatjuk át a reaktoron. A fenilalanin szintet a vérben szabályos időközökben ellenőrizzük. A kapott értékeket az alábbiakban táblázatosán megadjuk: Idő, perc Fenilalanin, mikromól/ml 0 0,70 15 0,55 30 0,42 60 0,23 90 0,07 A táblázat azt mutatja, hogy az alkalmazott körülmények között a fenilalanint körülbelül 90 perc alatt eltávolítottuk a vérből. A kísérletet hatszor megismételtük ugyanazokban a reaktorokban és a fenilalanin minden egyes esetben teljesen eltávolítható volt 90 perc alatt. 2. példa Két enzimes reaktort alkalmazunk az 1. példához hasonlóan és úgy kapcsoljuk azokat sorba, hogy lehetővé tegyék a vér testen kívüli keringését. A kísérlet során a combi artériából vért vezetünk a combi vénában egy kísérleti állatnál oly módon, hogy a vér átfolyik a két enzimes reaktoron. A reaktorok összeszerelése előtt a fenilalanin mennyisége a vérben 0,1 mikromól milliliterenként. A vérben található fenilalanin mennyisége 120 perc után gyakorlatilag nulla. 3. példa Az 1. példában megadott módon szálakat készítünk azzal az eltéréssel, hogy nem adunk a szálakhoz vériemezke-aggregálódást gátló anyagot. 5 g szálat egy termosztatikusan szabályozott csőreaktorban helyezünk el, amelynek az átmérője 40 mm, magassága pedig 220 mm. A reaktorba 0,4% koncentrációjú, foszfátpufferrel (0,01 mól, pH = 7,5) készített kazein-hidrolizátumot adunk be 600 milliliter/óra áramlási sebességgel. A fenilalaninkoncentráció 0,62 mikromól/ml, a tirozin-koncentráció pedig 0,45 mikromól/ml. A reaktorból távozó anyagban a fenilalánin-koncentráció 0,04 mikromól/ml míg a tirozin-koncentráció 0,05 mikromól/ml. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
