181930. lajstromszámú szabadalom • Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló faktor előállítására
181930 kezelünk, akkor a sejtszaporodást nagymértékben stimuláló anyag képződik (15 380 ± 4730, n = 4). Ez egy másik módja a faktor előállításának. Egy megfelelő, normál plazmából előállított extraktum neuraminidázzal kezelve nem mutat hasonló eredményt. 5 Ha a vérplazmából ily módon előállított előfaktort tripszin-kimotripszin keverékkel inkubáljuk, ahogyan ezt a részleges májeltávolításnak alávetett állatok maradék-májából készült extraktumra ismertettük, akkor itt is tönkretesszük ezáltal a májsejtek szaporodási aktivitását. Ez bizonyítja, 10 hogy a PT extraktum aktív faktora ugyancsak protein vagy proteid. A májból és a plazmából előállított faktorok tehát egymáshoz igen közel állnak. A hatásmechanizmussal kapcsolatban a következőket mondhatjuk: a TL-extraktum faktora nem tartalmaz neur- 15 aminsavat. A vérkeringésben lévő előfaktor ezzel ellentétben először még inaktív előformában, mint neuraminsav-tartalmú protein van jelen. Neuraminidáz hatására a neuraminsav lehasad, és így az aktív faktor képződik. Most már tudjuk, hogy részleges májeltávolításnál a májban magában spontán 20 felgyülemlik a neuraminidáz, és valószínűleg ez szabadítja fel az előfaktorból az aktív faktort. Ez megmagyarázza azt a tényt is, hogy egy PT-extraktum, tehát a még inaktív ejőforma beinjekciózása normál patkányoknál önmagában még nem stimulálja a májsejtek szaporodását. Az előfonnának 25 aktív faktorrá történő átalakításához szükséges neuraminidáz normális, részlegesen el nem távolított májakban egyáltalán nincs jelen, vagy nincs kielégítő mennyiségben jelen ahhoz, hogy a neuraminsavat lehasítsa, és így egy aktív faktor végleges kialakítását előidézze. Ezt csak a neuramini- 30 dáz végzi el, ami a maradék-májakban felgyülemlik. Az is lehetséges azonban, hogy a még inaktív előfaktor átalakítá sát aktív faktorrá a neuraminiltranszferáz végzi. Ez végbe mehet magában a vérplazmában, vagy magukban a májsej tekben is. Az, hogy ez a folyamat magában a vérplazmában 35 megy végbe, mindenképpen valószínűbb, mivel az előfaktort neuraminidázzal végzett kezelés után intraperitoneális injek dóban adjuk be, és az onnan a véren át a májsejtekbe jut A májsejtekben tehát receptoroknak kell lenni, amelyek a neuraminsav-mentes formát megkötik. Ez azt bizonyítja, 40 hogy az előfaktor már a vérben átalakul a neuraminsavmentes formává. Másrészt, ha a májsejtek egy részét eltávolítják, akkor a neuraminidáz-koncentráció a májban erősen növekszik. Ez a májban lévő enzim ugyancsak előidézheti az előfaktor 45 átalakítását neuraminsav-mentes formává. 7 Hasonlóképpen eljárva állíthatjuk elő a májsejtek szaporodását stimuláló faktort oly módon, hogy emlős-embriók vagy néhány hetes emlősök máját (nem csonkított, teljes máját), illetve vérplazmáját extraháljuk, mivel — amint azt a bevezető részben említettük — tudjuk azt, hogy eddig az életkorig a normál (tehát részleges májeltávolításnak alá nem vetett) állatoknál is sokkal nagyobb a sejtek szaporodási foka, mint idősebb állatoknál. Ebben az esetben is a vérplazmát extrahálva először az inaktív előfaktort állítjuk elő, ami neuraminidáz hatására aktívvá alakítható. Az ismertetett extrakdókkal a májsejtekben lévő faktort izoláljuk, illetve koncentráljuk. Elvileg tehát ez a faktor már jelen van a még nem extrahált májhomogenizátumban is. A teljes máj extraktumában azonban nem mutatható ki, mivel a teljes máj ilyen extraktumai igen mérgezőek, és az állatok az injekdó után rendszerint elpusztulnak. A fent megadott időtartamok, például a kísérleti állatok májának részleges kivétele és leölése közötti idő, az extraktum beinjekciózása és a timidin beinjekdózása közötti idő olyan értékek, amelyek kiváltképpen előnyösnek bizonyultak a kitermelés és a reprodukálhatóság szempontjából. A denaturálásnál a pH-értékre és hőmérsékletre megadott értékek felső határértékek. A találmány szerinti faktor, illetve előfaktor egyidejűleg stabilak a pH-értékre és a hőmérsékletre megadott értékeknél. 8 Szabadalmi igénypont Eljárás májsejtek szaporodását stimuláló, 30000— 50000 D molekulasúlyú, neuraminsavmentes proteinből vagy proteidből álló faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy a) részleges májeltávolításnak alávetett kísérleti állatok maradékmáját vagy embrionális vagy néhány hetes korukban leölt kísérleti állatok máját homogenizáljuk, pH-ját 5,5- re beállítjuk, 95 °C-on hőhatással denaturáljuk és centrifugálással a faktort tartalmazó felülúszót elválasztjuk, vagy b) részleges májeltávolításnak alávetett kísérleti állatok vagy embrionális vagy néhány hetes korukban leölt kísérleti állatok vérplazmájának pH-ját 5,5-re beállítjuk, 95 °C-on hőhatással denaturáljuk, centrifugálással a felülúszót elválasztjuk és neuraminidázzal kezeljük. A kiadásért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 84.SS8S.66-4 Alföldi Nyomda, Debrecen — Felelős vezető: Benkö István igazgató / i
