181926. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott fehérjék elkülönítésére albumintartalmú szuszpenziókból
181926 azonban egyrészt pirogén termékeket eredményezett, másrészt pedig nem javította a gazdaságosságot és alkalmatlan is volt nagyobb adagok feldolgozására. Jelentős lépés volt 1964-ben Polsen és munkatársainak javaslata, akik megállapították, hogy a polietilénglikol (PEG) jól alkalmazható, nem toxikus és nem pirogén kicsapatószer. Ezért ma már elteijedten alkalmazzák a gammaglobulin és a véralvadás-faktorkoncentrátumok előállításában. A Cohn-eljárás további részletei változatlanok maradtak. Ugyancsak jelentős volt Gabriel és munkatársainak találmánya, akik megállapították, hogy kaprilátok adagolása megvédi az albumint a denaturálódástól a hőkezelés közben. A gazdaságosság javításában jelentős lépésnek bizonyult a 2 415 079 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett eljárás, amely négy fő fázisból áll: 1. A plazma elkülönítése a vér szilárd és alvadást elősegítő, oldható alkotóitól és — kívánt esetben — az oldott, nem albumin-tartamú alkotók kinyerése; 2. A plazma melegítéssel való frakcionálása, amikoris a globulinokat kicsapják, míg az albumin oldatban marad. A műveletet úgy hajtják végre, hogy a globulinokat 60 és 75 °C közötti hőmérsékleten, albumin stabilizátorok, például nátrium-kaprilát jelenlétében, 7—12 tf%-os, CH3— —(CH2)n—OH általános képletű alkohol(ok)kal, amely képletben n=0,l vagy 2, kezelik; 3. A fenti módon hőkicsapott globulinok elválasztása centrifugálással; 4. Az albumin dúsítása az albumin-tartalmú oldatból. Az eljárással sikerült kiküszöbölni a drága hűtőberendezések alkalmazását, 4 napra csökkenteni a 8 napos feldolgozási időt, csökkenteni a berendezés igényt és javítani a munkakörülményeket a hidegkamrák kiküszöbölésével, miközben a termékek minősége változatlanul kifogástalan maradt. Továbbra sem sikerült azonban kiküszöbölni a munkaigényes, drága berendezést igénylő és igen lármás centrifugálást. A centrifugálás helyettesítésére is számos kísérlet történt és arra több javaslatot is tettek. Vizsgálták különböző módszerek alkalmazási lehetőségét, így például tanulmányozták a derítőszürést szén- és azbeszttárcsás szűrőkön, a szűrést cellulózbázisú szűrőrétegeken, üvegszálas szűrőkön és zsugorított üvegszürőkön. Minthogy azonban ezeknél a szűrési módszereknél vagy a szűrési idő volt túl hosszú, vagy a szűrőbetétek tömődtek el túl gyorsan, vagy pedig a szűrt folyadék volt túl zavaros, a globulinalbumin elválasztás egyedüli hatékony módszere továbbra is a drága és kényelmetlenül zajos centrifugálás maradt, sőt általánossá vált az a nézet, hogy a Cohn-eljárásból származó globulinok nem szűrhetők. Az újabban a tengerviz-sótalanításban, a kisebb teljesítményű berendezéseknél sikeresen bevezetett, ú.n. fordított ozmózisos eljárás mintájára a Cohn-féle eljárás céljaira is javasolták a membránszűrőkön végrehajtott ú.n. ultraszűrést. Ilyen eljárást ajánlanak a 2 005 260 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban is. Ennél a módszernél a kitűzött feladat valamely makromolekulás anyag oldatának koncentrálása vagy a makromolekulás anyag elkülönítése, oly módon, hogy az oldószert és az abban esetleg oldott sókat membránon át távolítják el. így például az említett nyilvánosságrahozatali irat 1. példája szerint vizes marhavérszémm-albuminoldatból a víz és az 3 oldott sók eltávolításával nyerik ki a marhavérszérumalbumint. Ezzel az eljárással azonban nem lehet a kicsapott fehérjéket elválasztani az albumintartalmú oldattól. Ha a találmányunk szerinti szuszpenziót kívánnók ezzel a módszerrel feldolgozni, a kívánt albumin és a nem kívánt fehérjék (például a gamma-globulinok) keverékét kapnék, ami éppenséggel ellentétes volna mind a találmányunk szerinti eljárás céljával, mind pedig a megoldani kívánt műszaki-gazdasági feladattal ill. céllal. Az ultraszűrés elvileg jól alkalmazható volna viszont a találmányunk szerinti eljárással már elválasztott albuminoldat koncentrálására, dúsítására, bár erre a feladatra ma még — ipari méretekben — túl költséges. Elvileg ugyancsak alkalmazható volna az ultraszűrés a találmányunkban kitűzött feladat megoldására is, amennyiben sikerülne olyan pórusnagyságú olcsó membránokat kifejleszteni, amelyek mind az oldószer, mind pedig az albumin molekuláit átengednék, az elválasztandó fehérjéket azonban nem. Ilyen membránokat kifejleszteni azonban eddig még nem sikerült és ilyeneket ebben az említett leírásban sem ismertetnek. Az eljárás emellett erre a célra költséges is volna és csak kisebb méretekben volna alkalmazható. Ajánlották végül a szérumproteinek elválasztására az oldószerpárokkal való megoszlásos elválasztást is, amelyet sok fokozatban és ellenáramú, lépcsős, megoszlásos centrifugában hajtanak végre. Ilyen eljárást ismertetnek Tavel és BoIIiger a Helvetica Chimica Acta 1968. évi, 51. kötetének 278— 293. lapjain. Az eljárás lényege, hogy valamely anyagot kisebb és nagyobb fajsúlyú cseppfolyós fázissal kezelnek, ahol a két cseppfolyós fázist két, eltérő oldóképességű oldószer alkotja, miközben a rétegek elválasztását centrifugálással gyorsítják. Ezzel a módszerrel különböző molekulanagyságú proteinok elválasztására tettek kísérletet. Az eljárás alkalmazásának azonban maguk a feltalálók szerint is komoly nehézségei vannak. Először is, nehéz olyan oldószerpárokat találni, amelyek a fehéijevegyületeket kielégítően oldják, anélkül, hogy azokat denaturálnák, másodszor pedig az eljárás csak akkor alkalmazható, ha a molekulasúlybeli illetve -nagyságbeli eltérések nagyok, hiszen a hasonló méretű molekulák azonos fázisba kerülnek, így az elválasztás ezzel a módszerrel igen nehéz, ha egyáltalán lehetséges. Márpedig az albumin eléggé egységes. Emellett az ajánlott centrifuga a Cohn-eljárásban és annak javított eljárásaiban alkalmazottaknál lényegesen drágább és azokénál sokkal kisebb teljesítményű is, így az ajánlott eljárás ipari méretekre teljességgel alkalmatlan. Találmányunk kidolgozásánál ezért az eredeti Cohn-eljárás lényeges megjavítását jelentő, a 2 415 079 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett eljárás további megjavítását tűztük ki célul az albumin elkülönítésére emberi vérből és hasonlókból, aholis a feladat olcsóbb, termelékenyebb és munkavédelmi szempontból megfelelőbb módszer kidolgozása az albumin elválasztására. A 68 °C-os hőkezeléssel kicsapott (a szakirodalomban használt kifejezéssel: hőkicsapott) globulinok és esetleges más, kicsapott fehérjék elkülönítése a 2 415 079 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratban ismertetett eljárás szerint 4,4 pH-értéknéi, folytonos átömlésű centrifugálással történik. A kicsapott fehérjék a forgórészekben gyűlnek össze, míg az albumin a felettük levő folyadékban marad. Ez az általánosan és más eljárásokban is alkalmazott, tehát a technika állását jelentő módszer két okból sem tőké-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6a 65 2
