181534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A/16686 jelű antibiotikum előállítására
5 181534 6 rást, asszimilálható nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmaz. A tápközeg bármely, a fermentációnál szokásosan alkalmazott táptalaj lehet, de bizonyos közegek előnyösek. Előnyös szénforrások például a glükóz, fruktóz, mannóz, szukróz és hasonlók. Előnyös nitrogénforrások a szójababliszt, pepton, húskivonat, élesztőkivonat, tripton, aminosavak és hasonlók. A tápközegekbe bevihető szervetlen sók közül azokat a szokásosan oldható sókat említjük meg, amelyek nátrium-, kálium-, vas-, cink-, kobalt-, magnézium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát- és hasonló ionokat szolgáltatnak. Az antibiotikumot termelő törzset egy rázólombikban előtenyésztjük és utána a tenyészetet széles szájú fermentorok beoltására használjuk jelentős mennyiségű A/16686 antibiotikum termelése érdekében. A közeg, amelyet az előtenyésztésnél használunk a nagyobb fermentációkhoz használt közeg lehet, de más közegeket is alkalmazhatunk. Az A/16686 antibiotikumot termelő törzs körülbelül 20 C° és 37 C° közötti hőmérsékleten fejlődik, az előnyös hőmérséklet pedig 28—30 C° tartományban van. A fermentáció folyamán az antibiotikumtermelést nyomon követhetjük oly módon, hogy a táptalaj vagy a szilárd micélium-kivonat mintáit megvizsgáljuk ántibiotikus aktivitás tekintetében. Az A/16686 antibiotikumra érzékeny ismert organizmusokat használjuk erre a célra. Egyik jól használható kísérleti organizmus a Sarcina lutea. A biokísérletet hagyományos módon agar diffúziós módszerrel agar lapokon végezzük. Legnagyobb mérvű antibiotikumtermelés általában körülbelül a harmadik és az ötödik nap között történik. Az Actinoplanes sp. ATCC 33076 törzs fermentálásánál az antibiotikumtermelés mind a táptalajban, mind a micéliummasszában végbemegy. Az A/16686 antibiotikum kinyerését a táptalaj és a micélium külön-külön történő extrahálásával végezzük. A micéliummassza extrahálását a legkedvezőbben metanollal végezzük, de más kis szénatomszámú alkoholok és a kloroform is alkalmas erre a célra. Az A/16686 antibiotikumot az extraháló oldószerből szokásos módon kapjuk nyerstermékként. Hasonló módon a táptalajt előnyösen n-butanollal extraháljuk és további mennyiségű A/16686 antibiotikumot kapunk nyerstermékként az oldatból való kicsapással. A nyers A/16686 antibiotikum tisztítását úgy végezzük, hogy az extraháló oldószerekből kinyert terméket 4:7:2 arányú kloroform : etanol : víz eleggyel kezeljük, a képződő olajos terméket elkülönítjük és vízbe öntjük. Ez a kezelés a termék megszilárdulását okozza, amelyet szűréssel elkülönítünk és szilikagél-oszlopon kromatográfiásan tovább tisztítunk, az eluálást 1:1 arányú acetonitril : 0,01 n HCl-oldateleggyel végezzük. Ily módon az A/16686 antibiotikumot hidroklorid formájában kapjuk, amelyet térhálósított dextrángél-oszlopon kezelünk kromatográfiásan és a sóformából felszabadítjuk az antibiotikumot. A tisztítás mindegyik lépését vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal követjük, amelynek során alkalmas oldószerrendszert, így bázikus oldószer-rendszer, például 2:3:4 arányú n-propanol : n-butanol : n-ammóniumhidroxidelegyet (felső fázis) vagy metanol : 10%-os vizes ammóniumacetát : 10%-os ammónium-hidroxid-elegyet 10:9:1 arány ban alkalmazunk, amelynek során az A/16686 antibiotikunr savaddiciós sóját szabad bázissá alakítjuk. A fenti lépések mindegyike hozzájárul ahhoz, hogy tiszta A/16686 antibiotikumot különítsünk el, amelyre jellegzetes Rf érték jellemző az alkalmazott oldószer-rendszernek megfelelően. Emellett más tisztítási módszerek is megfelelően alkalmazhatók, ide számítva a hagyományos extrakciós és adszorpciós módszereket is. Ezeket az alternatív módszereket lépésenként összeállíthatjuk és a tisztítás előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiával követjük, ahogy az előzőekben említettük. A megfelelő Rf értékű A/16686 antibiotikum vékonyréteg-kromatográfiás foltjának a figyelembe vételével a szakember megfelelően választhatja meg a műveleteket annak érdekében, hogy tiszta A/16686 antibiotikumot különíthessen el. Kívánt esetben a tiszta A/16686 antibiotikum hidrokloridját, amelyet a fenti módon kaptunk, a megfelelő szabad bázissá vagy más fiziológiailag elfogadható savaddiciós sóvá alakíthatjuk szokásos módszerekkel. Az A/16686 antibiotikum egy mikrobaellenes hatóanyag és különösen Gram-pozitív mikroorganizmusok ellen hatásos. Az A/16686 antibiotikum in vitro aktivitás-spektrumát a következő, IV. táblázatban foglaljuk össze. A táblázatban a mikroorganizmusokat és a legkisebb gátlókoncentrációt (M. I. C.) adjuk meg pg/ml-ben az A/16686 antibiotikumra. IV. táblázat Organizmus M.I.C. (ng/ml), A/16686 antibiotikum S. aureus ATCC 6538 0,16 S. aureus ATCC 9144 0,16 S. aureus Tour 0,31 Staphylococcus 10B Ciba 0,08 S. epidermidis ATCC 12228 0,08 S. saprophyticis NCTC 7292 0,16 M. flavus ATCC 10240 0,016 S. lutea ATCC 9341 0,02 S. pyrogenes C 203 SKF 13400 0,01 S. pneumoniae Felton UC 41 0,05 S. faecalis ATCC 7080 0,31 S. foecium ATCC 10541 0,08 S. agalactiae ATCC 7077 0,02 S. mutans ATCC 27607 0,08 C. diphtheriae var. mitis ATCC 11051 0,31 C. xerosis NCTC 9755 0,02 B. subtilis ATCC 6633 0,062 B. cereus var. mycoidés ATCC 11778 0,08 C. perfringens ISS 30543 0,16 P. acnes ATCC 6919 0,4 P. acnes ATCC 6922 0,8 P. acnes ATCC 25746 0,4 Az V. táblázat olyan kísérletek eredményeit mutatja be, amelyeknél az A/16686 antibiotikum hatását vizsgáltuk különböző klinikailag elkülönített Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae és Streptococcus faecalis törzsek ellen. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
