181442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aminocukor-származékok előállítására
9 181442 10 '20— az S. issifi,The timomyéanuln, R. :atíve 3altiészeíceus zása, liams ttlieb Speriol., erge■Villi- Acti- Sci., .mith . kiacatus lalof Wil>trep- Speyból, ICo. nlítáitják, -320 írom íytejsításasem micé-SP-3-íószí-A S. plicatus ISP 3319 törzs spóralánca főként spirálalakban jelentkezik az ISP-2-, -3-, -4- és 5-táptalajon. Bár hurokalakú légmicélium kevésbé gyakran figyelhető meg, az ISP 5319 törzsnél egyenes légmicéliummal nem találkoztunk, s ez megkülönbözteti a S. plicatust az NR—320— OM7HB törzstől. Ezenkívül alapvető különbséget láttunk a légmicélium elterjedése, a pigment-képződés, a koaguláltatás, zselatin-elfolyósítás valamint a szacharóz- és raffinózhasznosítás terén. A három vizsgált species közül a S. olivaceus áll a legköze- 10 lebb az NR—320—OM7HB törzshöz. A S. olivaceus ISP 5072 törzs az ISP-2-, -3-, -4- és -5-táptalajon a legtöbb helyen spirálalakú kifejlődést mutat; a légmicéliumon részben hurokalakú-egyenes-spóraláncokkal. E törzs azonban mind a NR—320-OM7HB mind a NR—320—OM7HBS törzstől 15 I abban különbözik, hogy egy nyaláb légmicéliumon belül egymásmellen spirálalakú, hurokalakú és egyenes spóraláncok vannak jelen, míg ez a jelenség a NR—320—OM7HB és NR—320—OM7HBS törzseknél nem figyelhető meg. Az ISP-5072 és NR—320—OM7HB törzsek között különbsége- 20 két figyeltünk meg az oldható pigmentképződés (ISP 5072 nem termel pigmentet ISP-2, -3-, -4- és -5-táptalajon), a légmicélium kialakulás (ISP 5072 esetében vékony légmicélium), a szénhidrát-hasznosítás (szacharóz-raffinóz) és az a-amiláz-inhibitor termelés (ISP 5072 metabolitok nem gátol- 25 ják) terén. A fenti eredmények azt mutatják, hogy az NR— 320—OM7HB és NR—320—OM7HBS törzsek legközelebbi | rokonságban a S. olivaceus ISP 5072 törzzsel állnak, azonban • nem azonosak e törzzsel. Fentiek alapján e taxont jogosan tekintjük a Streptomyces 30 genus új speciesének, melyet Streptomyces dimorphogenes nov.sp WATANABE és MARUYAMA 1978 jelöléssel láttunk el. A S. dimorphogenes típustörzse az NR—320— OM7HB (FERM—P No. 3664) törzs. Az etimológia — di (dual), (Gr.), morphe’ (Form)+Genesis — azon alapul, hogy 35 a spóralánc morfológiájában két forma van jelen (azaz kisebbségként spirálláncalakú csomók helyenkénti eloszlása). Egy biotípus — NR—320—OM7HBS (FERM—P No. 3665) — melyben a spóraláncok spirálalakja dominál, egyenes spóraláncok helyenkénti megjelenésével — célszerű elnevezése S. 40 dimorphogenes subsp. spiroformatus, a légmicélium morfológiára való utalással. Ennek megfelelően a FERM—P No. 3664 tipustörzs elnevezése S. dimorphogenes subsp. dimorphogenes. A találmányunk szerinti eljárással a tresztatinokat oly mó- 45 don állíthatjuk elő, hogy a Streptomyces genus valamely tresztatin-termelö mikroorganizmusát — pl. a Streptomyces dimorphogenes sp. nov. Watanabe és Maruyama (NR—320— OM7HB, FERM—P No. 3664) vagy Streptomyces dimorphogenes subsp. spiroformatus (NR—320—OM7HBS, 50 FERM—P No. 3665) törzset — aerob körülmények között vizes táptalajon tenyésztjük. A fermentációt a mikroorganizmusok által felhasználható szokásos tápanyagokat tartalmazó táptalajon végezhetjük el. Szénforrásként pl. keményítőt, dextrint, glükózt, glicerint, 55 szacharózt, trechalózt, melaszt vagy ezek keverékét alkalmazhatjuk. Nitrogénforrásként pl. szójababport, húsextraktot, peptont, élesztöelextraktot, kukoricalekvárt, ammóniumszulfátot, nátriumnitrátot, ammóniumkloridot vagy ezek keverékeit alkalmazhatjuk. A táptalaj szükség esetén megfelelő szer- 60 vétlen anyagokat (pl. kalciumkarbonátot, nátriumkloridot és/vagy cink-, réz-, mangán- vagy vas-sókat) tartalmazhat. A fermentációnál fellépő habképződés megakadályozása céljából habzásgátlókat (pl. szilikon vagy növényi olajok) adhatunk a rendszerhez. A fermentációt aerob körülmények között vizes közegben, különösen előnyösen szubmerz fermentációs feltételek mellett végezhetjük el. A pH a fermentáció elején 7 körüli érték. A hőmérséklet előnyösen 20—40 °C, különösen előnyösen 25 5 —30 "C. A fenti körülmények között végzett 1—5 napos fermentáció után a fermentléből a tresztatinok kinyerhetők. A fermentációt célszerűen abban az időpontban hagyjuk abba, amikor maximális tresztatin-hatékonyságot értünk el. A kapott tresztatinok mennyiségét a következőképpen határozhatjuk meg; Tresztatinok meghatározása A tresztatinok az a-amilázt erősen gátolják. Meghatározásuk ezen alapul; a Bemfeld P. [Methods in Enzimology 1,149 (1955)] féle a-amiláz teszt szerint. Két egység sertéspankreász-a-amiláz (egy egység a-amiláz az az enzimmennyiség, mely az alábbiakban ismertetésre kerülő körülmények között tresztatin nélkül 1 mp mól maltózzal egyenértékű mennyiségű redukáló cukor képződését katalizálja) és 0,1 ml 6,4 millimólos ammóniumszulfát elegyét 0,6 ml 20 millimólos foszfát-puíferhez (pH 6,9) adjuk, mely 10 millimól nátriumkloridot és különböző mennyiségű tresztatint tartalmaz. Az elegyet 37 °C-on 5 percen át állni hagyjuk, majd 0,5 ml 4%-os keményítő-oldatot adunk hozzá és 37 °C- on 5 percen át inkubáljuk. A reakciót 2 ml dinitro-szalicilsavreagens (előállítása Bemfeld P. szerint) hozzáadásával megszakítjuk. Az elegyet 5 percen át forrásban levő vízfürdőn melegítjük, majd 10 ml vízzel hígítjuk. A kapott megszíneződött oldat abszorpcióját (A2) 540nm-nél mérjük. Az aamilázgátló aktivitást az alábbi egyenlet segítségével számítjuk ki; Gátlás = ( 1 -Al~A° j x 100 (%) V A2-A,/ ahol A0=enzim nélkül mért abszorpció; A2 = tresztatin nélkül mért abszorpció. Gátlási egységként (IU) a fenti teszt-körülmények mellett 50%-os enzimgátlást előidéző tresztatin mennyiséget tekintjük. A fermentáció befejezése után a képződő tresztatinokat a fermentációs oldatból önmagukban ismert módszerekkel izoláljuk pl. a következőképpen: a micéliumot centrifugálással vagy szűréssel elkülönítjük; a tresztatinok vízben oldható gyengén bázikus anyagok. A tresztatinok izolálására és tisztítására a vízoldható bázikus anyagok izolálására és tisztítására alkalmas szokásos módszereket alkalmazhatjuk. így pl. abszorbensekkel (pl. aktívszén vagy kationcserélő gyanta) végzett adszorpciós módszereket; oldószerekkel (pl. egy alkohol vagy aceton) történő lecsapást; vagy kromatográfiás módszereket (pl. cellulóz vagy Sephadex alkalmazásával) vagy ezek kombinációit használhatjuk. A tresztatin A, tresztatin B és tresztatin C komponenseket különálló vegyületek alakjában célszerűen oszlopkromatográfiás úton, gyengén savas kationcserélő gyanta H-formája és ammónium-formája keverékének felhasználásával izolálhatjuk a fermentlé szűrletéből. Előnyösen a következőképpen járhatunk el: A fermentlé szűrletének pH-ját bázissal (pl. nátriumhidroxid, káliumhidroxid, nátriumkarbonát vagy káliumkarbonát) 7-re állítjuk be. A szűrlethez aktív szenet adunk, majd az oldatot leszűrjük. A tresztatinokat a szénről 30—70%-os 65 előnyösen 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluálószer 5
