181434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív FR-900156 anyag előállítására
15 181434 16 juk, az oldatot 251 CM-Sephadex H +-ciklusú gyantából készült oszlopra vezetjük. Az oszlopot 251 vízzel eluáljuk, az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 33 g sárgás fehér színű port kapunk. Ezt 1,21 cellulózból készült oszlop tetejére töltjük. 1000 ml 70%-os vizes propanollal mossuk az oszlopot, majd 1000 ml 60%-os vizes propanolial eluálunk. Az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 4,0 g fehér színű port kapunk. Ezt a port 150 ml vízben oldjuk, az oldatot 2,8 1 Sephadex G—15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot vízzel eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 4,0 g fehér színű port kapunk. A poralakú terméket 25 ml vízben oldjuk, az oldatot 400 ml H+ ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot vízzel eluáljuk. összegyűjtjük az aktív frakciókat, töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután fehér színű poralakú termékként 70%-os tisztaságú, 40 mg súlyú FR—900156 jelű anyagot kapunk. 2. példa Az 1. példában megadottak szerint eljárva fermentálunk. A fermentáció befejezése után 20 kg Radiolite (Showa Chemical Company) szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd a micélium eltávolítására szűrjük. 1600 1 szűrletet 8001 aktív szénből készült oszlopon vezetünk át, az oszlopot 16001 vízzel mossuk. 30001 50%-os vizes acetonnal eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot 6001 térfogatúra töményítjük. A sűrítményt DEAE-Sephadex (Pharmacia A. B.) gyantából (2001) készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-puffénál pufferoltuk. 200 1 vízzel, ezt követően 200 1 0,1N nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, majd 400 1 0,3M nátrium-klorid oldattal eluáljuk a hatóanyagot. A vizes eluátumot 2001 aktív szénből készült oszlopon vezetjük át, 2001 vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 400 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, majd fagyasztva szárítjuk, amiután 800 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 25 1 vízben oldjuk, az oldatot 251 H*-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopra vezetjük. 25 1 vízzel eluáljuk az oszlopot, az eluátumot töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, ezután 33 g sárgás fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 1,2 1 cellulóz gyantából készült oszlopra juttatjuk. 1000 ml 70%os vizes propanollal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 1000 ml 60%-os vizes propanollal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, azután 4 g fehér színű port kapunk. Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,41 DEAE-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 1,51 0,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, az eluálást 3 1 0,2M nátrium-klorid oldattal végezzük, összegyűjtjük az aktív frakciókat, majd egyesítjük őket, és 300 ml aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk. Vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 800 ml 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 700 mg fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 500 ml FT -ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. Az oszlopot vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, és töményítjük, amiután 10 ml sűrítményt kapunk. A sűrítményt 500 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást vízzel végezzük. Összegyűjtjük az aktív frakciókat és töményítjük őket, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amiután 70 mg fehér színű terméket kapunk. Ezt 25 ml vízben oldjuk, és preparatív vékonyrétegkromatográfiát végzünk cellulózon (Eastman Kodak Co.). Oldószerelegyként butanol, ecetsav és víz 4 : 1 : 2 arányú elegyét használjuk. Az eluálást 50 ml vízzel végezzük, az eluátumokat töményítjük, a sűrítményt fagyasztva szárítjuk, amiután fehér színű poralakú termékként 20 mg FR—900156 jelű vegyületet kapunk. 3. példa Az 1. példában megadottak szerint eljárva fermentálunk. A fermentáció befejezését követően 20 kg Radiolite (kereskedelmi név, Showa Chemical Company) szűrési segédanyagot adunk a fermentléhez, majd ezt követően a micélium eltávolítására szűrjük. 800 1 aktív szénből készült oszlopon 16001 szűrletet vezetünk át, az oszlopot 16001 vízzel mossuk. 3000 1 50%-os vizes acetonnal eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot 6001 térfogatra töményítjük. A sűrítményt DEAE-Sephadex oszlopon vezetjük át, a gyanta térfogata 2001 (kereskedelmi név, Pharmacia A. B.). Az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát pufferral pufferoltuk, 2001 vízzel, majd ezt követően 2001 0,1M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, az eluálást 0,3M nátrium-klorid oldattal végezzük. A vizes eluátumot 2001 aktív szénből készült oszlopon kromatografáljuk, az oszlopot 200 1 vízzel mossuk, az eluálást 400 1 50%-os vizes acetonnal végezzük. Töményítjük az eluátumot, majd ezt követően fagyasztva szárítjuk, amiután 800 g fehér színű poralakú terméket kapunk. Ezt 25 1 vízben oldjuk, az oldatot H ^-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült 25 1 térfogatú oszlopon vezetjük át. 251 vízzel eluáljuk a hatóanyagot, az eluátumot töményítjük, és fagyasztva szárítjuk, amiután 33 g sárgás fehér színű poralakú termékhez jutunk. Ezt 1,2 1 cellulóz gyantából készült oszlopra helyezzük. 1000 ml 70%-os vizes propanollal mossuk az oszlopot, az eluálást 1000 ml 60%-os vizes propanollal végezzük. Töményítjük az eluátumot, majd fagyasztva szárítjuk, amiután 4 g fehér színű port kapunk. Ezt 300 ml vízben oldjuk, az oldatot 1,41 DEAE-Sephadex (kereskedelmi név, Pharmacia A. B.) gyantából készült oszlopon vezetjük át, az oszlopot előzőleg 6,0 pH-jú foszfát-pufferral pufferoltuk. 1,5 1 0,1 M nátrium-klorid oldattal mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 30010,2M nátrium-klorid oldattal eluáljuk. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és 300 ml aktív szénből készült oszlopon vezetjük át. Vízzel mossuk az oszlopot, a hatóanyagot 800 ml 50%-os vizes acetonnal eluáljuk. Töményítjük az eluátumot, és azután fagyasztva szárítjuk, amiután 700 mg fehér színű port kapunk. Ezt 20 ml vízben oldjuk, az oldatot 500 ml FT-ciklusú CM-Sephadex gyantából készült oszlopon vezetjük át. A hatóanyagot vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat összegyűjtjük, majd töményítjük, amiután 10 ml sűrítményt kapunk. Ezt fagyasztva szárítva 400 mg poralakú termékhez jutunk. Ezt 500 ml cellulóz gyantából készült oszlopra helyezzük. A hatóanyag eluálását n-butanol, ecetsav és víz 4: 1 : 2 arányú elegyével végezzük. Összegyűjtjük az aktív frakciókat, és fagyasztva szárítjuk, amiután 200 mg poralakú terméket kapunk. Ezt 7 ml vízben oldjuk, az oldatot 250 ml Sephadex G 15 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Összegyűjtjük az aktív 5 IC 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
